Molekulare Modulation durch Lentivirus-gelieferte spezifische shRNAs in endoplasmatischen Retikulum-gestressten Neuronen
Summary
In der vorliegenden Studie wird die Expression von zwei nachgeschalteten Signalkomponenten des PERK-Signalwegs, dem zytoprotektiven Calcineurin und dem pro-apoptotischen CHOP, unter Verwendung spezifischer shRNAs abgeschaltet. Auf entgegengesetzte Weise modulieren diese die Anfälligkeit primärer kortikaler Neuronen für Neuritenatrophie nach Induktion von endoplasmatischem Retikulumstress.
Abstract
Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER), die durch einen Stresszustand verursacht wird, löst die ungefaltete Proteinantwort (UPR) durch die Aktivierung spezialisierter Sensoren aus. UPR versucht zunächst, die Homöostase wiederherzustellen; Wenn der Schaden jedoch anhält, induziert die Signalübertragung Apoptose.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass anhaltender und ungelöster ER-Stress zu vielen pathologischen Zuständen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, beiträgt. Da die UPR das Zellschicksal steuert, indem sie zwischen zytoprotektiven und apoptotischen Prozessen wechselt, ist es wichtig, die Ereignisse, die diesen Übergang definieren, sowie die Elemente, die an seiner Modulation beteiligt sind, zu verstehen.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine abnormale GM2-Gangliosidakkumulation zu einer Erschöpfung des ER Ca2+ -Gehalts führt, was wiederum PERK (PKR-like-ER-Kinase), einen der UPR-Sensoren, aktiviert. Darüber hinaus ist der PERK-Signalweg an der Neuritenatrophie und Apoptose beteiligt, die durch die GM2-Akkumulation induziert wird. In dieser Hinsicht haben wir ein experimentelles System etabliert, das es uns ermöglicht, die Expression von nachgeschalteten PERK-Komponenten molekular zu modulieren und so die Anfälligkeit von Neuronen für eine neuritische Atrophie zu verändern.
Wir führten einen Knockdown der Calcineurin- (zytoprotektiven) und CHOP- (pro-apoptotischen) Expression in kortikalen neuronalen Kulturen von Ratten durch. Die Zellen wurden mit Lentivirus-gelieferter spezifischer shRNA infiziert und dann zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit GM2 behandelt, fixiert und mit Anti-MAP2-Antikörpern (Mikroröhren-assoziiertes Protein 2) immungefärbt. Später wurden Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und das totale Neuritenwachstum mit der gemeinfreien Bildverarbeitungssoftware ImageJ ausgewertet. Die Hemmung der Expression dieser PERK-Signalkomponenten ermöglichte es eindeutig, die durch ER-Stress induzierte neuritische Atrophie entweder zu beschleunigen oder zu verzögern.
Dieser Ansatz könnte in Zellsystemmodellen von ER-Stress verwendet werden, um die Anfälligkeit von Neuronen für Neuritenatrophie zu bewerten.
Introduction
Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) ist definiert als jede Störung, die die Proteinfaltungskapazität in der Organelle beeinträchtigt. Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen innerhalb des ER-Lumens aktiviert ein Transduktionskaskadensignal, das als ungefaltete Proteinantwort (UPR) bezeichnet wird. Dieser komplexe Signalweg wird von drei Stresssensoren orchestriert: PERK (Proteinkinase-RNA [PKR]-ähnliche ER-Kinase), IRE1 (Inositol-erforderliches Enzym 1) und ATF6 (aktivierter Transkriptionsfaktor 6). Alle zusammen versuchen, die Homöostase wiederherzustellen. Wenn der Stress jedoch anhält, induziert UPR schließlich den Zelltod durch Apoptose1.
PERK, ein ER-Transmembranprotein, führt bei ER-Stress die Phosphorylierung des eukaryotischen Initiationsfaktor-2 alpha (eIF2α) an, wodurch die globale Proteinsynthese und damit die Proteinbelastung im ER2 reduziert wird. Wir konnten zeigen, dass Calcineurin-A/B (CNA/B), eine Heterodimer-Ca2+-Phosphatase, direkt an die zytosolische Domäne von PERK bindet, ihre Autophosphorylierung erhöht und die Hemmung der Proteintranslation und der Zelllebensfähigkeit signifikant erhöht 3,4. Interessanterweise ist CNA/B im Gehirn von Säugetieren reichlich vorhanden und unterscheidet zwei Isoformen der Untereinheit A von CN: α und β.
Bei anhaltendem ER-Stress ist der PERK-Signalweg der einzige UPR-Zweig, der aktiviert bleibt und somit sowohl die überlebensfördernde als auch die apoptotische Reaktion vermittelt. In der chronischen Phase ist ein wichtiges nachgeschaltetes Ereignis die Induktion des Transkriptionsfaktors CHOP (CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein homologes Protein)5. Chronischer ER-Stress wird auch zunehmend als häufiger Faktor für eine Vielzahl von pathologischen Störungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, anerkannt6. Es ist wichtig zu verstehen, wie UPR die zytoprotektive Signalübertragung anstelle des Zelltods erleichtern kann 7. Derzeit ist jedoch wenig über den genauen Mechanismus bekannt, der den Übergang zwischen diesen beiden UPR-Phasen steuert.
Kürzlich haben wir herausgefunden, dass sich Gangliosid GM2 in kultivierten Neuronen in ER-Membranen anreichert und einen luminalen Kalziummangel induziert. Dies wiederum aktiviert den PERK-Signalweg, der Neuritenatrophie und Apoptose vermittelt 8. In dieser Studie wird der GM2-Aufbau in kultivierten Neuronen als Zellsystemmodell für die ER-Stress-induzierte Neuritenatrophie verwendet. Konkret werden zwei PERK-Faktor-Ausdrücke manipuliert, CN-Aα und CHOP, die den Übergang zwischen frühen/protektiven Ereignissen und einer chronischen/apoptotischen Phase umschalten. Um dies zu erreichen, werden die jeweiligen Gene zum Schweigen gebracht; Daher werden primäre kortikale Neuronenkulturen mit Lentivirus-gelieferter spezifischer shRNA infiziert. Die Western-Blot-Analyse zeigt eine signifikante Reduktion der CN-Aα- und CHOP-Expressionsniveaus im Vergleich zu den Kontrollzellen, die mit Lentiviren infiziert sind, die eine verschlüsselte shRNA tragen. Nach dieser Behandlung werden die Neuronen unterschiedlichen Inkubationszeiten von exogenem GM2 ausgesetzt, fixiert und immungefärbt mit Anti-Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2)-Antikörper9. Die Bilder werden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Das gesamte Neuritenwachstum wird im Verhältnis zur Gesamtzellzahl bewertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein experimentelles System, das die molekulare Modulation des Übergangs von der Überlebens- zur apoptotischen UPR-Phase in einem neuronalen Zellmodell ermöglicht.
Für eine korrekte Analyse der Neuritenatrophie ist es wichtig, primäre Neuronenkulturen mit zahlreichen, langen, stark verzweigten Prozessen zu erhalten 9,11. Dies erleichtert die Untersuchung der Erweiterung des Neuronenprozesses, so dass die deutlichen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Gonzalo Quasollo für seine unschätzbare Hilfe bei der Bildgebung und Dr. Andrea Pellegrini für die technische Unterstützung der Zellkultur.
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse von: dem National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 zwischen UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) und von der National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentinien (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
Riferimenti
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