Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático
Summary
No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.
Abstract
O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do retículo endoplasmático (RE), causado por qualquer condição de estresse, desencadeia a resposta proteica desdobrada (UPR) através da ativação de sensores especializados. UPR tenta primeiro restaurar a homeostase; mas se o dano persistir, a sinalização induz a apoptose.
Há evidências crescentes de que o estresse ER sustentado e não resolvido contribui para muitas condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas. Como a RPU controla o destino celular alternando entre processos citoprotetores e apoptóticos, é essencial entender os eventos que definem essa transição, bem como os elementos envolvidos em sua modulação.
Recentemente, demonstramos que o acúmulo anormal de gangliosídeos GM2 causa o esgotamento do conteúdo de ER Ca2+ , que por sua vez ativa a PERK (PKR-like-ER quinase), um dos sensores UPR. Além disso, a sinalização PERK participa da atrofia neurítica e da apoptose induzida pelo acúmulo de GM2. A este respeito, estabelecemos um sistema experimental que nos permite modular molecularmente a expressão de componentes PERK a jusante e, assim, alterar a vulnerabilidade dos neurônios para sofrer atrofia neurítica.
Realizamos knockdown da expressão de calcineurina (citoprotetora) e CHOP (pró-apoptótica) em culturas neuronais corticais de ratos. As células foram infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus e, em seguida, tratadas com GM2 em diferentes momentos, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-MAP2 (proteína 2 associada a microtubos). Posteriormente, as imagens celulares foram registradas usando um microscópio de fluorescência e o crescimento total de neuritos foi avaliado usando o software de processamento de imagens de domínio público ImageJ. A inibição da expressão desses componentes de sinalização PERK claramente tornou possível acelerar ou retardar a atrofia neurítica induzida pelo estresse do RE.
Essa abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse de RE para avaliar a vulnerabilidade dos neurônios à atrofia de neuritos.
Introduction
O estresse do retículo endoplasmático (RE) é definido como qualquer perturbação que comprometa a capacidade de dobramento de proteínas na organela. O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do lúmen do ER ativa um sinal de cascata de transdução chamado resposta proteica desdobrada (UPR). Esta via de sinalização complexa é orquestrada por três sensores de estresse: PERK (proteína quinase RNA [PKR]-like ER quinase), IRE1 (enzima 1 que requer inositol) e ATF6 (fator de transcrição ativado 6). Todos juntos tentam restaurar a homeostase. Mas se o estresse persistir, a RPU eventualmente induz a morte celular por apoptose1.
PERK, uma proteína transmembrana de RE, sob estresse de RE, lidera a fosforilação do fator de iniciação eucariótico-2 alfa (eIF2α), reduzindo a síntese proteica global e, portanto, a carga proteica no RE2. Demonstramos que a calcineurina A/B (CNA/B), um heterodímero Ca2+ fosfatase, liga-se diretamente ao domínio citosólico da PERK, aumentando sua autofosforilação e aumentando significativamente a inibição da tradução de proteínas e a viabilidade celular 3,4. Curiosamente, o CNA/B é abundante no cérebro de mamíferos, distinguindo duas isoformas da subunidade A do CN: α e β.
Sob estresse sustentado do RE, a via de sinalização PERK é o único ramo UPR que permanece ativado, mediando assim tanto a resposta pró-sobrevivência quanto a resposta apoptótica. Na fase crônica, um dos principais eventos a jusante é a indução do fator de transcrição, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homóloga protein)5. O estresse crônico do RE também é cada vez mais reconhecido como um contribuinte comum para uma extensa gama de distúrbios patológicos, incluindo doenças neurodegenerativas6. É importante compreender como a RPU pode facilitar a sinalização citoprotetora em vez da morte celular 7. No entanto, atualmente pouco se sabe sobre o mecanismo exato que controla a transição entre essas duas fases da RPU.
Recentemente, descobrimos que, em neurônios cultivados, o gangliosídeo GM2 se acumula nas membranas do RE e induz a depleção de cálcio luminal. Isso, por sua vez, ativa a sinalização PERK, que medeia a atrofia neurítica e a apoptose 8. Neste estudo, o acúmulo de GM2 em neurônios cultivados é usado como um modelo de sistema celular de atrofia de neurite induzida por estresse de ER. Especificamente, duas expressões do fator PERK são manipuladas, CN-Aα e CHOP, o que alterna a transição entre eventos precoces/protetores e uma fase crônica/apoptótica. Para conseguir isso, os respectivos genes são silenciados; assim, as culturas primárias de neurônios corticais são infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus. A análise de Western blot revela uma redução significativa dos níveis de expressão de CN-Aα e CHOP em comparação com as células de controle, que estão infectadas com lentivírus que carregam um shRNA embaralhado. Após esse tratamento, os neurônios são submetidos a diferentes tempos de incubação de GM2 exógeno, fixo e imunocorado com anticorpo anti-proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2)9. As imagens são obtidas com um microscópio de epifluorescência. O crescimento total de neuritos é avaliado em relação ao número total de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um sistema experimental que permite a modulação molecular da transição das fases de sobrevida para UPR apoptótica em um modelo celular neuronal.
Para uma análise adequada da atrofia neurítica, é essencial a obtenção de culturas primárias de neurônios com processos numerosos, longos e altamente ramificados 9,11. Isso facilita o exame da extensão do processo dos neurônios, permitindo que as diferenças claras en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Gonzalo Quasollo por sua inestimável ajuda com imagens e à Dra. Andrea Pellegrini pelo suporte técnico de cultura celular.
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de: National Institute of Health, EUA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
Riferimenti
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