Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 Redigering av C. elegans rbm-3.2 Gen ved hjelp av dpy-10 Co-CRISPR Screening og montert Ribonucleoprotein Complexes.

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62001
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å muliggjøre sømløs CRISPR/Cas9-redigering av C. elegans-genomet ved hjelp av monterte ribonukleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren for screening. Denne protokollen kan brukes til å gjøre en rekke genetiske modifikasjoner i C. elegans, inkludert innsettinger, slettinger, generstatninger og codon-substitusjoner.

Abstract

Det bakterielle Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-assosiert proteinsystem (Cas) har blitt utnyttet av forskere for å studere viktige biologisk relevante problemer. Crispr/Cas genomredigeringsmetodens enestående kraft gjør det mulig for forskere å redigere ethvert locus etter eget valg, og dermed legge til rette for økt forståelse av genfunksjon. Flere metoder for redigering av C. elegans-genomet av CRISPR/Cas9 er beskrevet tidligere. Her diskuterer og demonstrerer vi en metode som benytter in vitro montert ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren for screening. Spesielt i denne artikkelen går vi gjennom den trinnvise prosessen med å introdusere for tidlig stoppkokoner i C. elegans rbm-3.2-genet ved homologistyrt reparasjon ved hjelp av denne metoden for CRISPR / Cas9-redigering. Denne relativt enkle redigeringsmetoden kan brukes til å studere funksjonen til ethvert gen av interesse og tillater generering av homozygot-redigerte C. elegans ved CRISPR / Cas9-redigering på mindre enn to uker.

Introduction

Teknologien Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) muliggjør effektiv målrettet genomredigering i et bredt spekter av organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet ble først oppdaget som en del av en prokaryotisk antiviral immunrespons5,6,7. Type II CRISPR-systemet bruker en endonuklease som Cas9, en transaktiverende RNA (tracrRNA) og en kort, mål DNA-spesifikk 20-nukleotid lang guide CRISPR RNA (crRNA) for å gjenkjenne en "NGG" Protospacer Tilstøtende motiv (PAM) og gjøre en dobbeltstrenget pause i målet DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denne dobbeltstrengede pausen er anerkjent som en lesjon av det cellulære DNA-reparasjonsmaskineriet. Følgelig kan den genererte dobbeltstrengede pausen repareres av en av to veier - i) Ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller ii) Homology-rettet reparasjon (HDR)13. NHEJ er ofte feilutsatt, og derfor, når denne banen brukes til å reparere det dobbeltstrengede bruddet i mål-DNA-et, forårsaker det ofte inaktiverende mutasjoner (innsettinger, slettinger) i genet av interesse. På den annen side, ved å levere en eksogen reparasjonsmal med homologi til hver side av dobbeltstrengsbruddet, kan det cellulære DNA-reparasjonsmaskineriet rettes til å bruke HDR til å reparere pausen13. HDR-metoden muliggjør dermed presis redigering av ethvert locus av interesse.

En rekke CRISPR/Cas9 genredigeringsprotokoller er beskrevet for C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De mest brukte CRISPR/Cas9-redigeringsmetodene i C. elegans inkluderer både kloningsbaserte og kloningsfrie protokoller for å generere reparasjonsmaler for CRISPR/Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Denne protokollen drøfter i detalj en kloningsfri CRISPR/Cas9-redigeringsprotokoll basert på bruk av dpy-10 som co-CRISPR-markør for screening. Inntil nå bruker den eneste detaljerte C. elegans-fokuserteCRISPR / Cas9-redigeringsvideoprotokollen som eksisterer en fluorescerende markør for screening21. Bruk av fluorescerende markør for screening krever imidlertid tilgang til et fluorescensmikroskop, som mange laboratorier ved små primært undergraduate institusjoner (PUIer) kan finne vanskelig å få tilgang til. Det er oppmuntrende å merke seg at positive korrelative resultater er oppnådd i tidligere studier mellom ormer som bærer fluorescerende markører og tilstedeværelsen av redigeringen21,22. Imidlertid er ytterligere studier nødvendige for å bestemme den generelle effektiviteten til fluorescensbasert screeningmetode for redigering av et bredt utvalg av loci med forskjellige guide RNAer og reparasjonsmaler. Til slutt, siden plasmidkodingen for disse fluorescerende markørene danner ekstrakromosomale matriser, produseres variabel fluorescens ofte fra disse matrisene som kan gjøre positive vanskelig å identifisere23. Derfor, selv om fluorescensbasert screeningmetode kan være nyttig å ta i bruk, kan de ovennevnte problemene begrense anvendbarheten.

Hvis du bruker en CO-CRISPR-markør som produserer en synlig fenotype, reduseres antallet avkom som må screenes, betraktelig for å finne en positivt redigert orm23,24,25,26,27,28. Det er viktig at fenotypene som produseres av disse markørene lett kan oppdages under et enkelt dissekeringsmikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR-markøren er en av de best karakteriserte og mye brukte co-CRISPR-markørene for å utføre C. elegans CRISPR / Cas9 genomredigering24,27. Derfor vil denne artikkelen diskutere metoden for å utføre CRISPR / Cas9-redigering i C. elegans ved hjelp av direkte levering av ribonukleoproteinkomplekser med dpy-10 som en co-CRISPR-markør27,35. I denne metoden består den forberedte redigeringsinjeksjonsblandingen av en godt karakterisert dpy-10 crRNA og dpy-10 reparasjonsmal for å formidle genereringen av en observerbar dominerende "roller" (Rol) fenotype som er overdratt av en kjent heterozygot dpy-10(cn64) mutasjon i dpy-10-genet 24,27,29. Når den er tilstede i sin homozygote tilstand, forårsaker dpy-10 (cn64) mutasjonen en dumpy (Dpy) fenotype som produserer kortere og stouter ormer24,29. Rol-fenotypen formidles av nøyaktig innsetting av den medfølgende dpy-10-reparasjonsmalen i en enkelt kopi av dpy-10-genet ved HDR-mediert CRISPR/Cas9-redigering. Derfor indikerer utseendet til Rol C. elegans en vellykket injeksjon samt en vellykket HDR-mediert redigeringshendelse i cellene til den injiserte ormen. Siden crRNA og reparasjonsmalen til målgenet av interesse er i samme injeksjonsblanding med dpy-10 crRNA og dpy-10 reparasjonsmal, er det en god sjanse for at de identifiserte Rol-ormene også samtidig ble redigert på målgenet av interesse. Derfor blir disse Rol-ormene deretter screenet for redigering av interesse ved teknikker som polymerasekjedereaksjon (PCR) (for redigeringer større enn 50 bp) eller av PCR etterfulgt av begrensningsfordøyetid (for redigeringer mindre enn 50 bp).

Fordelene ved å bruke denne metoden for genomredigering er: i) CRISPR-redigeringer kan genereres ved en relativt høy effektivitet (2% til 70%) ved hjelp av denne metoden27; ii) reparasjonsmalene og guide RNAene som brukes i denne metoden innebærer ikke kloning, og reduserer dermed tiden som kreves for deres generasjon; iii) ved å montere ribonukleoproteinkomplekser in vitro, konsentrasjonene av de monterte redigeringskompleksene kan opprettholdes relativt konstant, og dermed forbedre reproduserbarheten; iv) noen guide RNAer som ikke klarer å generere redigeringer når uttrykt fra plasmider har vist seg å fungere for CRISPR / Cas9 genomredigering når den leveres som in vitro transkribert crRNAs27; v) inkludert dpy-10 co-CRISPR markøren muliggjør enkel screening ved hjelp av et dissekerende mikroskop og reduserer antall avkom som må screenes for å finne positive24,27; og vi) DNA-sekvensering verifiserte homozygot-redigerte ormlinjer kan oppnås ved denne metoden innen et par uker19,27.

Utmerkede bokkapitler knyttet til mange forskjellige C. elegans CRISPR-metoder har blitt publisert14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrasjonen av dpy-10 co-CRISPR-metoden i et videoformat i en laboratorieinnstilling mangler imidlertid for øyeblikket. I denne artikkelen beskriver og demonstrerer vi prosessen med å bruke dpy-10 co-CRISPR-metoden for å redigere et representativt målgen kalt rbm-3.2, et putativt RNA-bindende protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Spesielt beskriver vi i detalj metoden for å introdusere tre for tidlig stopp codons innenfor C. elegans rbm-3.2 genet ved hjelp av in vitro montert ribonucleoprotein komplekser og en eksogent levert lineær enkeltstrenget reparasjon mal. Disse studiene har vært vellykkede med å generere den første C. elegans CRISPR-stammen med for tidlig stoppkokoner i rbm-3.2-genet. Siden ikke mye er kjent om funksjonen til dette genet i C. elegans, vil denne stammen tjene som et nyttig verktøy for å dissekere funksjonen til RMB-3.2. Denne metoden kan også vedtas for å gjøre innsettinger, substitusjoner og slettinger ved ethvert locus i C. elegans-genomet.

Protocol

Denne protokollen for CRISPR/Cas9 genomredigering ble godkjent av University of Tulsa Institutional Biosafety Committee etter NIH-retningslinjer. Gjennom hele denne protokollen ble steril teknikk praktisert. Alle trinnene i denne protokollen ble utført ved hjelp av reagenser som var fri for nukleaser. Det ble tatt særlig hensyn til rnaseforurensning som rengjøringshansker samt arbeidsområder og utstyr (f.eks. pipetter, utsiden av glass, etc.) med en RNase dekontamineringsløsning.

1. crRNA-design

  1. Finn PAM som gjør det mulig for Cas9 å kutte nærmest redigeringsområdet.
    1. PAM-nettstedet er 5'-NGG-3'.
    2. Husk at PAM kan være på en av trådene av DNA-et.
  2. Velg 20 bp på slutten av PAM som crRNA-sekvens.
    MERK: Den faktiske crRNA-sekvensen som syntetiseres av kommersielle selskaper er lengre enn 20 bp, da den har en ekstra generisk sekvens som automatisk legges til den målspesifikke 20 bp crRNA-sekvensen av syntetiseringsselskapet. Når det gjelder off-target effekter, nyere studier har ikke funnet off-target effekter av Cas9 i C. elegans36,37,38,39,40. Videre er de resulterende CRISPR-redigerte stammene overdrevet. Derfor er vi ikke veldig opptatt av off-target effekter av de designede crRNAs. Imidlertid kan nettsteder, inkludert http://genome.sfu.ca/crispr/ og http://crispor.tefor.net/, brukes til å finne og velge crRNAene med minst off-target effekter38,41. crRNAer som slutter med en G eller GG, og de med mer enn 50 % GC-innhold, forventes å være mer effektive19,23,42.
  3. Bestill minst 10 nmol crRNA fra et selskap (f.eks.
    1. Når den lyofiliserte crRNA kommer, oppbevar den ved -30 °C til mikroinjeksjonsdagen.
    2. På dagen for å utføre mikroinjeksjonen, spinn den lyofiliserte crRNA med maksimal hastighet (17.000 x g) i ett minutt og resuspend den i 5 mM Tris-Cl (pH 7.4) for å lage en 8 μg / μL lager av crRNA.
    3. Oppbevar det ubrukte crRNA-lageret frosset ved -80 °C.

2. Reparasjonsmaldesign

  1. Last ned en sekvensmanipuleringsprogramvare (f.eks. clc sequence viewer, APE, Snapgene, Vector NTI, etc.). Vi bruker CLC sequence viewer versjon 8.0 (Qiagen) som det er brukervennlig og kan lastes ned gratis.
  2. Lim inn sekvensen av mål-DNA-et av interesse i sekvensviseren.
  3. Retningen til reparasjonsmalen påvirker redigeringseffektiviteten28. For å sette inn en reparasjonssekvens i 5' enden av PAM, design en enkeltstrenget reparasjonsmal med DNA-sekvens fra samme DNA-streng som PAM-sekvensen ligger på (protospacer strand)28. Mens du setter inn en reparasjonssekvens i 3' enden av PAM, design en enkeltstrenget reparasjonsmal med DNA-sekvens fra DNA-strengen som ikke bærer PAM-sekvensen (spacer strand)28.
  4. Velg 35 basispar med sekvens med uavbrutt homologi på begge sider (på slutten av 5' og 3' av redigeringen.
  5. Muter eller slett PAM for å forhindre kutting av reparasjonsmalen eller det redigerte genomiske DNA-et av Cas9.
    1. Hvis mutasjon av PAM ikke er mulig, kan du introdusere flere stille mutasjoner nær 5' enden av PAM for å forhindre kutting av reparasjonsmalen eller det redigerte genomiske DNA.
    2. Sørg for å bare introdusere stille mutasjoner av PAM hvis den er til stede i en eksonisk region.
    3. Kontroller codonbruksfrekvensen for å sikre at den muterte codonen introduseres med en frekvens som kan sammenlignes med den opprinnelige ikke-muterte codonen (f.eks. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). I noen tilfeller er det kanskje ikke mulig å introdusere den muterte codonen med en lignende frekvens som den umuterte codonen. Men for å lage mutasjoner av noen få aminosyrer, forventer vi ikke at uttrykksnivået til mutantproteinet endres betydelig.
  6. Hvis redigeringen er liten (f.eks. mutasjon av noen få baser), introduserer du et unikt begrensningsområde nær redigeringen ved stille mutagenese. Vi bruker http://heimanlab.com/cut2.html for å finne begrensningssider som kan introduseres ved stille mutagenese.
    1. Kontroller codonbruksfrekvensen for å sikre at den muterte codonen introduseres med en frekvens som kan sammenlignes med den opprinnelige ikke-muterte codonen. Som nevnt ovenfor er dette ikke alltid mulig. Men for eksperimenter som involverer mutasjoner av noen få aminosyrer, forventer vi ikke at uttrykksnivået til mutantproteinet endres betydelig.
  7. Syntetiser og kjøp lineære enkeltstrengede reparasjonsmaler for HDR som 4 nmol ultramer oligos.
  8. Resuspend den lyofiliserte oligonukleotidreparasjonsmalen i nukleasefritt vann for å lage en 1 μg / μL lager av reparasjonsmalen og lagre den ved -30 ° C til videre bruk.

3. Screening primer design

  1. Bruk CLC sequence viewer eller andre lignende applikasjoner, design 20 til 23 basepar fremover og omvendt primere på hver side av redigeringen henholdsvis, slik at de produserer et bånd på mellom 400 og 600 basepar på PCR-forsterkning.
    1. Hvis du vil ha større innsettinger som har flere kilobaser, utformer du den fremre primeren slik at den er plassert like utenfor venstre homologiarm i reparasjonsmalen. Utform den omvendte primeren som skal plasseres i selve reparasjonsmalen. I dette tilfellet vil et PCR-produkt bare bli oppnådd ved positivt redigerte ormer.
    2. Hvis du vil identifisere homozygote redigerte ormer for lengre innsettinger, forsterker du hele området for innsettingen ved å utforme fremover og bakover primere som er plassert utenfor innsettingskryssene.
  2. Test primerne og optimaliser PCR-forholdene med genomisk DNA av villtype før du bruker primerne til genotyping.
    1. Sørg for at et enkelt bånd av forventet størrelse produseres ved PCR-forsterkning av det genomiske DNA-et (der det er aktuelt).

4. Forbereder unge voksne ormer til injeksjon

  1. Plukk L2-L3 trinn C. elegans på en frisk bakteriell plen på en MYOB-tallerken og inkuber ved 20 °C over natten.
    MERK: Protokollen for å lage MYOB-plater finner du her: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. På dagen for mikroinjeksjon, velg unge voksne ormer med færre enn 10 embryoer i livmoren for å injisere.

5. Klargjøring av injeksjonsblandingen

  1. Klargjør injeksjonsblandingen i samme rekkefølge som vist i tabell 1 i sterile nukleasefrie rør.
    MERK: Komponentene i injeksjonsblandingen kan skaleres ned for å lage 5 μL injeksjonsblandinger (i stedet for 20 μL) hvis fremtidige injeksjoner med denne blandingen ikke forventes.
  2. Bland injeksjonsblandingen ved å pipettere.
  3. Inkuber injeksjonsblandingen ved 37 °C i 15 minutter for å montere ribonukleoproteinkomplekser.
  4. Snurr injeksjonsblandingen ved 4 °C ved 17 000 x g i 5 minutter.

6. Mikroinjeksjon inn i C. elegans gonad

  1. Utfør mikroinjeksjon av CRISPR injeksjonsblandingen i C. elegans gonad, som beskrevet i Iyer et al. 201943.
    1. Injiser ca. 30 ormer med CRISPR injeksjonsblanding. Den ubrukte injeksjonsblandingen kan brukes på nytt ved lagring ved 4 °C i en periode på ca. 6 måneder uten tap av effektivitet49.
    2. Injiser begge gonadarmene hvis mulig. Injiserte ormer regnes som P0-generasjonen.

7. Injisert ormgjenoppretting og overføring

  1. Etter mikroinjeksjon, flytt mikroinjiserte P0 ormer ved hjelp av en orm-pick til en 60 mm MYOB agar plate frø med OP50 E. coli og la dem gjenopprette ved romtemperatur i omtrent en time.
    1. Vær oppmerksom på at utvinningstemperaturen vil avhenge av genotypen til de injiserte ormene. For eksempel, for temperaturfølsomme stammer, kan ormgjenoppretting ved en annen temperatur være nødvendig.
  2. Bruk en platina wire orm plukke, overføre hver injisert orm på en enkelt frø 35 mm MYOB agar petri plate og la dem legge egg ved 20 °C til neste dag.
    1. Vær oppmerksom på at noen ormer vil dø som følge av skade fra mikroinjeksjonsprosedyren. Bare velg de ormene som er i live og vis bevegelse.
  3. Etter 24 timer, overfør de injiserte ormene til nye individuelle plater (1 orm per plate).

8. Plukk C. elegans for screening

  1. 3 til 4 dager ved 20 °C etter at injeksjonen er utført, må du overvåke alle platene som inneholder avkommet til de injiserte ormene ved hjelp av et dissekeringsmikroskop.
  2. Identifiser plater som har F1 avkom som viser rulle (Rol) og dumpy (Dpy) fenotyper. En Dpy fenotype er der ormer vises kortere og stouter enn kontroll ormer på samme utviklingsstadium (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Plater med Rol- og Dpy-ormer representerer plater der F 1-avkomet har blitt redigert med dpy-10 (cn64) mutasjonen for å være til stede i henholdsvis sin heterozygote eller homozygote tilstand.
  3. Velg platene med flest rulle- og dumpy ormer for screening.
  4. Single ut 50 til 100 F1 Rol ormer fra disse platene til sine egne individuelle plater (1 orm per tallerken) og la dem legge egg.
    1. La L4-iscenesatte F1 Rol ormer legge egg og produsere avkom (F2) i 1 til 2 dager.

9. Single orm lysis og PCR

  1. Etter å ha produsert F2 i 1 til 2 dager, overføre hver singlet F1 Rol mor til 2,5 μL lysis buffer (Tabell 2) med en 1:100 fortynning av 20 mg / ml Proteinase K.
  2. Frys rørene ved -30 °C i 20 minutter. Ormene kan lagres på dette stadiet i en lengre periode inntil videre analyse.
  3. Utfør enkeltormlys på en PCR termosykler med følgende forhold: 60 °C i 1 time, 95 °C i 15 minutter og hold ved 4 °C.
  4. Legg til følgende reagenser direkte til 2,5 μL av den lysede ormen som inneholder PCR-rør: 12,5 μL 2x PCR-blanding som inneholder dNTPer, DNA-polymerase, MgCl2 og lastfargestoff, 1 μL 10 μM fremoverprimer, 1 μL 10 μM reversprimer og sterilt vann til 22,5 μL. Det totale volumet av hver PCR-reaksjon er 25 μL.
    MERK: Ved screening av flere F1-ormer er det raskere og mer praktisk å lage en PCR-masterblanding for flere reaksjoner og legge til 22,5 μL masterblanding til hvert lysisrør.
  5. Sett opp PCR-reaksjoner på en termosykler med følgende forhold: 95 °C i 1 minutt, 35 sykluser på 95 °C i 15 s, 55 °C i 15 s (optimaliser for hvert primersett), 72 °C i 1 minutt (optimaliser for hvert mål-DNA)44. Hold reaksjoner ved 4 °C.

10. Begrensning fordøyelse og agarose gel elektroforese

MERK: En begrensningsfordøyetid er bare nødvendig under screening for små redigeringer (mindre enn 50 bp).

  1. Overfør 10 μL av PCR DNA fra trinn 9 til et nytt rør.
  2. Tilsett mellom 2 og 4 enheter av begrensningsenzym og 1x begrensning enzymbuffer (1,5 μL 10x reaksjonsbuffer) per 15 μL reaksjon.
  3. Inkuber ved 37 °C (eller ved annen enzymspesifikk temperatur) i 2 timer (kortere inkubasjonstider kan være mulig med hurtigvirkende enzymer).
  4. Varm opp begrensningen ved å varme opp PCR-rørene ved 65 °C (eller annen enzymspesifikk temperatur) i 10 til 15 minutter.
  5. Legg hele reaksjonen fra hvert PCR-rør i en enkelt brønn på en 1%-2% agarose gel og kjør gel ved 110 mA til riktig båndseparasjon oppnås.
    MERK: Vi bruker en PCR-blanding som allerede har et lastefargestoff inkludert for visualisering mens du kjører på en agarosegel. Denne blandingen forstyrrer ikke begrensningsfordøyelighetsreaksjonen og er derfor praktisk å bruke til screening av mange ormer på en gang.

11. Identifiser positivt redigerte ormer

  1. Visualiser agarose geler under UV-lys (for ethidiumbromidgeler) for å oppdage DNA-båndstørrelser.
    MERK: Positivt redigerte ormer vil vise et ekstra dna-bånd i forventet størrelse på grunn av redigering ved hjelp av reparasjonsmalen som bærer begrensningsstedet på ønsket locus i ormgenomet. F1 rulle ormer forventes å være heterozygote for redigeringen og forventes derfor å vise tre bånd (ett wild-type uklippet PCR-produkt og to mindre fragmenter fra det redigerte kuttet PCR-produktet). Selv om det er sjeldent, må det bemerkes at homozygoter oppstår av og til.
  2. Lagre alle de opprinnelige positivt redigerte platene til redigeringen er bekreftet av Sanger-sekvensering.

12. Homozygose redigering av interesse

  1. Velg mellom 8 og 12 wild-type ser ikke-rullende F2 ormer fra de respektive positivt redigerte F1 Rol ormplater og la dem legge egg og produsere avkom i 1 til 2 dager.
    MERK: Siden C. elegans er selvbefruktende hermafroditter, hvis den redigerte allelen ikke påvirker levedyktighet eller utvikling, bør andelen forventede homozygote mutanter være ca. 25%. Ikke-rullende F2 ormer må være wild-type for dpy-10 locus. Plukking av ikke-rullende ormer muliggjør generering av redigerte ormer som har mistet dpy-10 (cn64) mutasjonen og bare har mutasjonen ved ditt gen av interesse.
    1. Legg merke til at dpy-10-genet er til stede på kromosom II. Hvis ditt gen av interesse er knyttet til dpy-10, kan det hende du ikke lett kan skille dpy-10 mutasjonen bort fra ditt gen av interesse.
  2. Utfør trinn 9 til 11 for å identifisere homozygote ormelinjer.

13. Bekreft redigering ved sekvensering

  1. Når homozygote ormer er identifisert, utfør lysis og PCR som beskrevet i trinn 9.
    1. Konfigurer minst 3 PCR-reaksjoner for hver homozygote linje som skal sekvenseres.
  2. Rens PCR-reaksjonene ved hjelp av et PCR-rensesett.
  3. Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et nanodråpespektrofotometer.
  4. Send eksempel med den respektive fremoverprimeren for Sanger-sekvensering. Kontroller at den fremre primeren er utformet for å være minst 50 baser unna redigeringen som skal sekvenseres.
  5. Analyser sekvenseringsresultatene ved hjelp av programvare for sekvensanalyse for å bekrefte at redigeringen finnes.

Representative Results

rbm-3.2 er et putativt RNA-bindende protein som har homologi til human spalting stimulering faktor subenhet 2 tau variant (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). RBM-3.2-proteinet ble identifisert som en bindende partner av Protein Phosphatase 1 (GSP-1) og dets regulatorer Inhibitor-2 (I-2SZY-2) og SDS-22 i en tidligere studie som identifiserte disse proteinene som nye regulatorer av C. elegans centriole duplisering (data ikke vist)45. For tiden er svært lite kjent om funksjonen til rbm-3.2-genet i C. elegans. Derfor, for å undersøke den biologiske rollen til C. elegans rbm-3.2 genet, ble rbm-3.2-null allele rbm-3.2 (ok688) hentet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

Dessverre, i tillegg til å ha en sletting av hele rbm-3.2-genet, resulterer rbm-3.2 (ok688) allelen også i en delvis sletting av et overlappende gen, rbm-3.1, og dermed kompliserer genetisk analyse. Derfor, for å nøyaktig undersøke rollen til rbm-3.2-genet i C. elegans, brukte vi CRISPR / Cas9-redigering for å introdusere tre for tidlig stoppkokoner svært nær starten av C. elegans rbm-3.2-kodeområdet, slik at det overlappende rbm-3.1-genet er intakt.

For å introdusere disse for tidlige stoppkokonene i C. elegans rbm-3.2-genet, designet vi en crRNA med et PAM-motiv som lå på motsatt tråd (malstreng) av DNA ( Figur1A). Cas9 cut site var plassert 6 baser unna rbm-3.2 start codon ATG. For å introdusere for tidlig stopp codons i rbm-3.2 genet, vi designet en reparasjon mal med følgende fem hovedkarakteristikker: 1) 35 baser av uavbrutt homologi til rbm-3.2 oppstrøms av rbm-3.2 start codon (venstre homologi arm) 2) En kort strekning av baser som inneholder PAM-motivet ble slettet 3) Et EcoRI-begrensningssted ble introdusert umiddelbart etter starten codon for screening 4) Den andre og den tredje kokonene av rbm-3.2 ble slettet og tre stopp codons ble introdusert etter den femte RBM-3.2 codon å stoppe oversettelsen av rbm-3.2 mRNA 5) 35 baser av uavbrutt homologi til den første intron av rbm-3.2 ble inkludert nedstrøms av redigeringen (høyre homologi arm) ( Figur1B).

Injeksjonsblandingen for dette CRISPR-eksperimentet ble fremstilt som angitt i tabell I. Injeksjonsblandingen ble inkubert ved 37 °C i 15 minutter for å montere ribonukleoproteinkomplekser. Blandingen ble deretter sentrifugert og lastet inn i den trukket mikroinjeksjonsnålen. Mikroinjeksjon i C. elegansgonad ble utført som beskrevet i Iyer et al. 201943.

Figur 2 viser den eksperimentelle tidslinjen for generering av redigerte C. eleganer ved hjelp av denne protokollen. Selv om vi vanligvis injiserer 30 ormer for hvert CRISPR-eksperiment, injiserer noen laboratorier færre ormer (mellom 10 og 20) for hvert CRISPR-eksperiment. Siden innsetting av flere ormer øker sannsynligheten for å finne positive redigeringer, foretrekker vi å injisere et større antall ormer. Mange laboratorier velger "jackpot" brød (plater med større enn 50% Rol og Dpy avkom) for screening. Etter vår erfaring etter å ha utført flere CRISPR-eksperimenter, selv om jackpot-brød oppstår av og til, et flertall av ganger, kommer Rol-ormene som er plukket ut til screening ofte fra mange forskjellige P0-plater, som hver består av noen få Rol-avkom. Ingen jackpot broods ble oppnådd i dette eksperimentet.

Totalt screenet vi det genomiske DNA-et til 73 F1 Rol ormer som ble hentet fra 7 injiserte P0 ormer for tilstedeværelsen av redigeringen. Sekvensene av screeningprimerne og deres plasseringer med hensyn til startkodonen til rbm-3.2-genet er representert i figur 3A. Gjennom vår analyse ble 7 av 73 F1 ormer funnet å være positive for redigeringen (9,5%) ( Figur3B). Uredigerte ormer viste et enkelt DNA-fragment på 445 bp ved EcoRI-fordøyelsen. Mens ormer som bærer en for tidlig stopp codon i rbm-3.2 genet viste to fragmenter av henholdsvis 265 bp og 166 bp ved EcoRI-fordøyelsen. Heterozygot-redigerte ormer viste tre fragmenter ved EcoRI-fordøyelsen: ett villtype uredigert DNA-fragment på henholdsvis 445 bp og to DNA-fragmenter på henholdsvis 265 bp og 166 bp fra den redigerte kopien av rbm-3.2-genet.

For å identifisere ormer som bærer homozygote redigeringer, overførte vi 12 F2 ormer fra de identifiserte positive F 1-heterozygotene på nye individuelle plater og tillot dem å produsere avkom (F3). F2-ormene ble deretter screenet for homozygositet som beskrevet tidligere. 6 av 12 (50%) screened ormer ble funnet å være homozygote for vår redigering av interesse (Figur 4A). Det genomiske DNA-et til en identifisert homozygot-redigert ormlinje ble brukt til å sette opp en DNA-sekvenseringsreaksjon. DNA-sekvenseringsanalyse bekreftet tilstedeværelsen av redigeringen i sin homozygote tilstand (Figur 4B). Generelt er det gunstig å sekvensere flere homozygote ormlinjer for å sikre at alle homozygot-redigerte ormelinjer viser samme fenotype (hvis nullmutasjonen produserer en bestemt fenotype). Videre kan det også være nødvendig å validere gen knockouts ved hjelp av en uttrykksbasert analyse som vestlig blotting eller RT-PCR eller via fenotype analyse. Dette er fordi det er mulig at til tross for å innføre premature stoppkosoner i begynnelsen av genet, kan en alternativ ATG være til stede nedstrøms for tidlig stopp codons. Denne ATG-en kan brukes til å initiere proteinuttrykk, noe som resulterer i et delvis funksjonelt avkortet protein.

Reagent Konsentrasjon Volum som skal legges til
Cas9 protein i nukleasefritt vann med 20% glyserol 2 μg/μL 5 μL
tracrRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL
dpy-10 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL
rbm-3,2 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL
dpy-10 reparasjonsmal i sterilt nukleasefritt vann 500 ng/μL 0,55 μL
rbm-3.2 reparasjon mal i sterilt nukleasefritt vann 1 μg/μL 2,2 μL
KCl i sterilt nukleasefritt vann 1 M 0,5 μL
sterilt nukleasefritt vann - 5,35 μL

Tabell 1: Komponenter i injeksjonsblandingen for CRISPR/Cas9-redigering ved hjelp av ribonukleoproteinkomplekser og dpy-10 som co-CRISPR-markør. Bruk sterile teknikker og RNase-frie reagenser mens du lager injeksjonsblandingen. Vær oppmerksom på at sterilt, ikke-DEPC-behandlet nukleasefritt vann ble brukt til å lage injeksjonsblandingen.

Reagent Konsentrasjon Volum som skal legges til
KCl 1 M 5 ml
Tris-HCl pH 8.3 1 M 1 ml
MgCl2 1 M 250 μL
NP-40 (eller IGEPAL CA-630) 100% 450 μL
Tween-20 100% 450 μL
Gelatin 2% 500 μL
Vann - 92,35 ml

Tabell 2: Worm lysis buffer oppskrift. Ormen lysis buffer kan gjøres i bulk, autoklavert, filtrert og aliquoted for langsiktig lagring (MERK: lysisbufferen kan lagres i over et år ved romtemperatur). Tilsett en 1:100 fortynning av 20 mg/ml proteinase K i ormelysbufferen like før hver bruk.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk som viser crRNA- og reparasjonsmalutforming for rbm-3.2 for tidlig stopp CRISPR. A. Skjematisk viser kodings- og malstrengene til rbm-3.2-genet med crRNA-sekvensen og PAM-motivsekvensen som ligger på malstrengen. B. Skjematisk representerer de forskjellige egenskapene til reparasjonsmalen som ble syntetisert for å introdusere tre for tidlig stoppkokoner i rbm-3.2-genet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentell tidslinje for generering avhomozygot-redigerte C. elegans ved CRISPR/Cas9-redigering ved hjelp av forhåndsmonterte ribonukleoproteinkomplekser og dpy-10 som co-CRISPR-markør. En daglig oversikt over trinnene som må utføres for å generere homozygot-redigerte C. elegans ved hjelp av denne metoden for CRISPR / Cas9-redigering. Kort sagt ble 30 ormer injisert med CRISPR-redigeringsblandingen ved hjelp av mikroinjeksjon og adskilt på individuelle MYOB-plater frøet med OP50 E. coli. Etter 24 timer ble de injiserte P0-ormene overført til friske nye MYOB-plater og fikk lov til å fortsette å legge egg. På dag 3 og 4 etter mikroinjeksjon ble platene undersøkt for tilstedeværelse av Rol F1 ormer. Platene med maksimalt antall Rol og Dpy F1 ormer ble valgt og 73 F1 Rol ormer (vi velger vanligvis mellom 50 og 100 F1 Rol ormer per CRISPR-eksperiment) ble singlet på nye individuelle MYOB-plater (1 orm per plate) og fikk lov til å legge egg i ca 2 dager. På dag 6 etter mikroinjeksjon ble ormlysater tilberedt fra F1 ormer som hadde produsert avkom (F2) og ble screenet for tilstedeværelsen av redigeringen av PCR etterfulgt av begrensning fordøyelse med EcoRI og agarose gel elektroforese. På dag 7, 12 ikke-Rol, ikke-Dpy F2 ormer ble overført fra de positive platene til nye individuelle plater og fikk lov til å produsere avkom (F3). På dag 9 ble F2-ormene vist for homozygositet av redigeringen som beskrevet tidligere. På dag 10 ble ormlys, PCR og PCR-opprydding utført for de homozygote F 3-ormene, og DNA-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av et NanoDrop-spektrofotometer. På dag 11 ble sangersekvenseringsreaksjoner satt opp for positive prøver, og reaksjonene ble sendt til DNA-sekvensering. På dag 12 ble sekvenseringsresultatene analysert, og tilstedeværelsen av redigeringen ble bekreftet ved hjelp av en sekvensanalyseprogramvare (f.eks. clc-sekvensvisning). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Screening for C. elegans som er heterozygote for rbm-3.2 premature stop codons. Agarose gel elektroforese bilder av C. elegans genomisk PCR DNA fordøyd med EcoRI. 73 individuelle F1 ormer ble genotypet og screenet for tilstedeværelsen av rbm-3.2 redigering. Røde tall og stjerner angir positivt redigerte ormer. Alle de 7 identifiserte positivt redigerte C. elegans var heterozygote for redigeringen da de viste et villtype uredigert DNA-fragment på henholdsvis 445 bp og to DNA-fragmenter på henholdsvis 265 bp og 166 bp fra den redigerte kopien av rbm-3.2-genet ved EcoRI-fordøyelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Identifisere og verifisere homozygot-redigerte C. elegans som bærer rbm-3.2 for tidlig stopp codons. A. Screening for C. elegans som er homozygote for rbm-3.2 for tidlig stopp codons. Agarose gel elektroforese bilder av C. elegans genomisk DNA fordøyd med EcoRI. 12 individuelle F2 ormer fra positive plater ble genotypet og screenet for homozygositet av rbm-3.2 redigering. Rød: homozygot-redigerte ormer. 6 av de 12 screenedE F2 ormene (50%) var homozygote for rbm-3.2 for tidlig stopp codons. Det finnes ikke noe PCR-produkt for orm 7. B. Bekrefter innsetting av for tidlig stopp codons i rbm-3.2 ved DNA-sekvensering. Skjematisk som viser sammenligningen av DNA- og proteinsekvenser av uredigerte og redigerte homozygoter. Analyse av DNA-sekvenseringsresultater av genomisk DNA fra homozygot-redigerte ormer bekreftet tilstedeværelsen av de tre for tidlige stoppkokonene i rbm-3.2-genet ved CRISPR / Cas9-redigering. Alle resulterende aminosyreendringer etter CRISPR/Cas9-redigering er angitt i enten røde bokstaver eller røde stjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Vi har brukt protokollen ovenfor til å redigere flere gener i tillegg til rbm-3.2. Vår redigeringseffektivitet for forskjellige loci-, guide-RNAer og reparasjonsmaler (enkeltstrengede og dobbeltstrengede) har variert mellom 2% og 58% (data ikke vist). Den observerte redigeringseffektiviteten kan sammenlignes med den tidligere rapporterte redigeringseffektiviteten på 2 % til 70 % for denne protokollen27. Vi har også lykkes i å bruke denne teknikken til å gjøre genslettinger. Ved hjelp av to crRNAer erstattet vi et gen som er nær 6 kb i lengde med kodesekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) (data ikke vist). For dette eksperimentet ble omtrent 14% av Rol F1-ormene som ble analysert funnet å være positive for gensletting og erstatning med GFP (data ikke vist). Det kreves imidlertid flere eksperimenter for å bestemme maksimal lengde på gensletting og erstatninger som kan utføres ved hjelp av denne teknikken.

Denne teknikken kan brukes til å gjøre innsettinger som er omtrent 1,6 kB i lengde19. En nylig studie har vist at for å lage innsettinger som er over 1,6 kb lange ved hjelp av denne protokollen, kan generering av to dobbeltstrengsbrudd og bruk av reparasjonsmaler med lengre homologiarmer muliggjøre innsetting av mye større fragmenter av DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan flere runder med genredigering med denne protokollen utføres for å generere større redigeringer. Andre plasmidbaserte C. elegans CRISPR/Cas9 genredigeringsprotokoller kan også tas i bruk for CRISPR-eksperimenter som involverer innsetting av DNA-fragmenter større enn 1,6 kb46,47,48.

Før du bruker denne protokollen for genredigering, er det nødvendig å sikre at genet av interesse ikke er knyttet til dpy-10 locus på kromosom II. Når det gjelder et målgen som er knyttet til dpy-10, kan det være problematisk å skille dpy-10-mutasjonen bort fra din redigering av interesse. Derfor, i tilfelle at genet av interesse er knyttet til dpy-10 locus, Andre co-CRISPR-markører som unc-58 (X-kromosom), unc-22 eller zen-4 (kromosomIV) og Ben-1 eller pha-1 (kromosom III) som er plassert på forskjellige kromosomer, kan brukes24,25,26,28. Data fra Meyer-laboratoriet viser at Ben-1- og zen-4-mutasjoner kan brukes som vellykkede co-CRISPR-markører for screening med denne metoden28. Det er imidlertid viktig å merke seg at bruk av zen-4 og pha-1 som co-CRISPR-markører nødvendiggjør å utføre CRISPR-eksperimentet i ikke-wild-type zen-4(cle10ts) eller pha-1(e2123ts) bakgrunn henholdsvis26,28. Videre kan CRISPR-eksperimenter som involverer noen co-CRISPR-markører som Ben-1 kreve tilberedning av spesialplater (f.eks. plater som inneholder benzimidazol)28. Vi har med hell brukt unc-58 co-CRISPR-markøren til å screene for positive redigeringer for et gen som er knyttet til dpy-10 ved hjelp av denne metoden (data ikke vist). Mutasjonen uk-58(e665) gir en synlig fenotype (lammelse) som effektivt kan brukes til å screene for positivt redigerte ormer24. Alternativt, hvis tilgang til et fluorescerende mikroskop er tilgjengelig, kan et fluorescerende merket gtbp-1-gen også brukes som en co-CRISPR-markør for denne protokollen19.

For høy redigeringseffektivitet mens du bruker denne metoden for genomredigering, må redigeringsstedet være innenfor 10 til 30 baser fra Cas9-skjæreområdet. Hvis redigeringsområdet er over 30 baser unna Cas9-skjæreområdet, faller redigeringseffektiviteten drastisk19,35,37. En nylig studie fra Meyer-laboratoriet har imidlertid vist at å lage to dobbeltstrengspauser på avstand fra hverandre kan muliggjøre innsetting av redigeringer langt borte fra Cas9-kuttet nettsted ved hjelp av denne protokollen28.

I gjeldende protokoll ble reparasjonsmalen utformet slik at alle de tre innsatte stoppkokonene vises i samme leseramme. En alternativ strategi for å lage nullmutanter vil imidlertid være å bruke en universell 43-basers lang knock-in STOP-IN-kassett som tidligere er beskrevet50. Viktigst, denne kassetten har stopp codons i alle de tre mulige leserammer og forårsaker frameshift mutasjoner. Dette er en spesielt nyttig strategi for å generere nullmutanter når feil eller ufullstendig reparasjon skjer på redigeringsområdet.

Til slutt, på grunn av sin korte varighet og de siste fremskrittene i denne metoden, er dette en utmerket metode for rutinemessige laboratorieforsøk som involverer tilsetning av korte immunogene epitopkoder, fluorescerende koder, gjør gensletting, generstatninger og codon-substitusjoner.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfond fra Universitetet i Tulsa (TU) og TU Faculty Development Summer Fellowship tildelt Jyoti Iyer. Vi vil takke Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) og Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) for å tildele stipender til studentene som er involvert i denne studien. Vi vil gjerne anerkjenne Ms. Caroline Dunn for hennes tekniske assistanse. Til slutt vil vi takke Dr. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter og Saili Moghe for deres kritiske kommentarer til dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
EcoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, Humana Press. New York, NY. 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518 (2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128 (2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186 (2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O'Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543 (2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Tags

Genetikk Utgave 166 CRISPR/Cas9 C. elegans ribonukleoproteinkomplekser genomteknikk rbm-3.2 genredigering mikroinjeksjon CRISPR-screening
CRISPR/Cas9 Redigering av <em>C. elegans rbm-3.2</em> Gen ved hjelp av <em>dpy-10</em> Co-CRISPR Screening og montert Ribonucleoprotein Complexes.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E.,… More

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter