माउस में सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण
Summary
हम मुराइन दिल में साइनोएट्रियल नोड (एसएएन) और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) में पेसमेकर कोशिकाओं द्वारा शारीरिक रूप से उत्पन्न विद्युत संकेत चालन प्रणाली के माध्यम से आयोजित किया जाता है, जिसमें पूरे दिल के उत्तेजना और संकुचन की अनुमति देने के लिए एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) शामिल है। सैन या एवीएन की किसी भी शिथिलता के परिणामस्वरूप अतालता होती है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अरिदमोजेनेसिस में उनकी मौलिक भूमिका का संकेत देती है। माउस मॉडल का व्यापक रूप से अतालता अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, लेकिन सैन और एवीएन की विशिष्ट जांच चुनौतीपूर्ण बनी हुई है।
सैन बेहतर वेना कावा के साथ क्रिस्टा टर्मिनलिस के जंक्शन पर स्थित है और एवीएन कोच के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है, जो कोरोनरी साइनस के छिद्र, ट्राइकसपिड एन्यूलस और टोडारो के कण्डरा द्वारा बनाया गया है। हालांकि, छोटे आकार के कारण, पारंपरिक हिस्टोलॉजी द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन चुनौतीपूर्ण रहता है और यह अपने 3 डी वातावरण के भीतर सैन और एवीएन के अध्ययन की अनुमति नहीं देता है।
यहां हम एक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो लेबल किए गए माउस सैन और एवीएन के स्थानीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इस उद्देश्य के लिए, माउस के दिल को विच्छेदित किया जाता है, अवांछित ऊतक को हटा दिया जाता है, इसके बाद निर्धारण, परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग होती है। सैन और एवीएन के भीतर चालन प्रणाली की कोशिकाओं को तब एंटी-एचसीएन 4 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जाता है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण नोडल कोशिकाओं और काम करने वाले कार्डियोमायोसाइट्स के बीच भेदभाव की अनुमति देते हैं, और स्पष्ट रूप से सैन और एवीएन को स्थानीयकृत करते हैं। इसके अलावा, अतिरिक्त एंटीबॉडी को अन्य सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए भी जोड़ा जा सकता है, जैसे तंत्रिका फाइबर।
पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोलॉजी की तुलना में, होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हृदय चालन प्रणाली की शारीरिक अखंडता को संरक्षित करता है, इस प्रकार एवीएन की जांच की अनुमति देता है; विशेष रूप से उनकी शारीरिक रचना और आसपास के काम करने वाले मायोकार्डियम और गैर-मायोसाइट कोशिकाओं के साथ बातचीत में।
Introduction
अतालता लाखों लोगों को प्रभावित करने वाली आम बीमारियां हैं, और दुनिया भर में महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर का कारण हैं। उपचार और रोकथाम में भारी प्रगति के बावजूद, जैसे कि कार्डियक पेसमेकर का विकास, अतालता का उपचार चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, मुख्य रूप से अंतर्निहित रोग तंत्र 1,2,3 के बारे में बहुत सीमित ज्ञान के कारण। सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अतालता के पैथोफिज़ियोलॉजी दोनों की बेहतर समझ भविष्य में नवीन, अभिनव और कारण उपचार रणनीतियों को विकसित करने में मदद कर सकती है। इसके अतिरिक्त, अरिदमोजेनेसिस का व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए, माउस जैसे पशु मॉडल में विशिष्ट कार्डियक चालन प्रणाली को स्थानीयकृत और कल्पना करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि चूहों का व्यापक रूप से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है।
कार्डियक चालन प्रणाली के प्रमुख भाग सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) हैं, जहां विद्युत आवेग विशेष पेसमेकर कोशिकाओं में उत्पन्न होता है, और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन), जो एट्रिया और वेंट्रिकल्स4 के बीच एकमात्र विद्युत कनेक्शन है। जब भी सैन और एवीएन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को बदल दिया जाता है, तो बीमार साइनस सिंड्रोम या एट्रियोवेंट्रिकुलर ब्लॉक जैसे अतालता हो सकती है जो हेमोडायनामिक गिरावट, सिंकोप और यहां तक कि मृत्यु का कारण बन सकती है, और इस प्रकार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और एरिथमोजेनेसिस5 में सैन और एवीएन दोनों की आवश्यक भूमिका को रेखांकित करती है।
सैन या एवीएन पर व्यापक अध्ययन के लिए दोनों संरचनाओं के सटीक स्थानीयकरण और विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है, आदर्श रूप से उनके शारीरिक वातावरण के भीतर। हालांकि, काम करने वाले मायोकार्डियम के भीतर उनके छोटे आकार और स्थान के कारण, एक स्पष्ट मैक्रोस्कोपिक रूप से दृश्यमान संरचना स्थापित किए बिना, सैन और एवीएन की शारीरिक रचना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है। एनाटोमिकल लैंडमार्क का उपयोग मोटे तौर पर उस क्षेत्र की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिसमें सैन और एवीएन 6,7,8 शामिल हैं। संक्षेप में, सैन पेशी क्रिस्टा टर्मिनलिस (सीटी) से सटे दाहिने आलिंद के अंतर-कैवल क्षेत्र में स्थित है, एवीएन ट्राइकसपिड वाल्व, कोरोनरी साइनस के ओस्टियम और टोडारो के कण्डरा द्वारा स्थापित कोच के त्रिकोण के भीतर स्थित है। इस प्रकार, इन शारीरिक स्थलों का उपयोग मुख्य रूप से सैन और एवीएन को व्यक्तिगत संरचनाओं (जैसे, पारंपरिक हिस्टोलॉजी द्वारा) के रूप में स्थानीयकृत करने, हटाने और फिर अध्ययन करने के लिए किया गया था। सैन और एवीएन के जटिल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए (उदाहरण के लिए, काम करने वाले मायोकार्डियम के आसन्न कोशिकाओं के नियामक प्रभाव), हालांकि, फिजियोलॉजिकल 3 डी वातावरण के भीतर चालन प्रणालियों का अध्ययन करना आवश्यक है।
होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग एक विधि है जिसका उपयोग आसपास के ऊतक9 की अखंडता को संरक्षित करते हुए सीटू में शारीरिक संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लाभ उठाते हुए, सैन और एवीएन को फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के साथ कल्पना की जा सकती है जो विशेष रूप से इन क्षेत्रों में व्यक्त आयन चैनलों को लक्षित करते हैं।
यह निम्नलिखित प्रोटोकॉल सैन और एवीएन माइक्रोस्कोप स्थानीयकरण और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित होल-माउंट स्टेनिंग विधि करने के लिए आवश्यक चरणों की व्याख्या करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल बताता है कि (1) स्टेनिंग और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए इन नमूनों को तैयार करने के लिए शारीरिक स्थलों द्वारा सैन और एवीएन को स्थानीयकृत करने के लिए (2) संदर्भ मार्कर एचसीएन 4 और सीएक्स 43 (3) के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए सैन और एवीएन नमूने तैयार करने के लिए (4) सैन और एवीएन की कॉन्फोकल इमेजिंग करने के लिए। हम यह भी वर्णन करते हैं कि इस प्रोटोकॉल को आसपास के मायोकार्डियम या गैर-मायोसाइट कोशिकाओं जैसे स्वायत्त तंत्रिका तंतुओं के अतिरिक्त धुंधलापन को शामिल करने के लिए कैसे संशोधित किया जा सकता है जो हृदय के भीतर हृदय चालन प्रणाली की गहन जांच की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्डियक एनाटॉमी का अध्ययन पारंपरिक रूप से पतले हिस्टोलॉजिकल सेक्शन11 का उपयोग करके किया गया है। हालांकि, ये विधियां चालन प्रणाली की त्रि-आयामी संरचना को संरक्षित नहीं करती हैं और इस प्रकार, क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी, आर ज़िया), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस क्लॉस, 81जेड0600206 से एस काब), कोरोना फाउंडेशन (एस199/10079/2019 से एस क्लॉस), एसएफबी 914 (परियोजना जेड01 से एच. इशिकावा-एंकरहोल्ड) और एस. 10 से 1000-1019 और एस. पांडुलिपि तैयार करने में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
