Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo
Summary
Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.
Abstract
O sinal elétrico fisiologicamente gerado pelas células do marcapasso no nó sinoatrial (SAN) é conduzido através do sistema de condução, que inclui o nó atrioventricular (AVN), para permitir a excitação e contração de todo o coração. Qualquer disfunção de SAN ou AVN resulta em arritmias, indicando seu papel fundamental na eletrofisiologia e arritmogênese. Modelos de camundongos são amplamente utilizados na pesquisa de arritmia, mas a investigação específica de SAN e AVN permanece desafiadora.
A SAN está localizada na junção da crista terminal com a veia cava superior e a AVN está localizada no ápice do triângulo de Koch, formado pelo orifício do seio coronariano, do anel tricúspide e do tendão de Todaro. No entanto, devido ao pequeno tamanho, a visualização pela histologia convencional continua sendo desafiadora e não permite o estudo de SAN e AVN dentro de seu ambiente 3D.
Aqui descrevemos uma abordagem de imunofluorescência de montagem inteira que permite a visualização local de SAN e AVN de camundongos marcados. A coloração de imunofluorescência de montagem inteira destina-se a seções menores de tecido sem a necessidade de seccionamento manual. Para este fim, o coração do rato é dissecado, com tecido indesejado removido, seguido de fixação, permeabilização e bloqueio. As células do sistema de condução dentro da SAN e da AVN são então coradas com um anticorpo anti-HCN4. A microscopia confocal de varredura a laser e o processamento de imagem permitem a diferenciação entre células nodais e cardiomiócitos em funcionamento e localizam claramente a SAN e a AVN. Além disso, anticorpos adicionais podem ser combinados para rotular outros tipos de células também, como fibras nervosas.
Em comparação com a imuno-histologia convencional, a coloração por imunofluorescência de montagem completa preserva a integridade anatômica do sistema de condução cardíaca, permitindo assim a investigação da AVN; especialmente em sua anatomia e interações com o miocárdio de trabalho circundante e células não-miócitos.
Introduction
As arritmias são doenças comuns que afetam milhões de pessoas e são a causa de morbidade e mortalidade significativas em todo o mundo. Apesar dos enormes avanços no tratamento e na prevenção, como o desenvolvimento de marcapassos cardíacos, o tratamento das arritmias permanece desafiador, principalmente devido ao conhecimento muito limitado sobre os mecanismos da doença de base 1,2,3. Uma melhor compreensão da eletrofisiologia normal e da fisiopatologia das arritmias pode ajudar a desenvolver estratégias de tratamento novas, inovadoras e causais no futuro. Além disso, para estudar de forma abrangente a arritmogênese, é importante localizar e visualizar o sistema de condução cardíaca específico em modelos animais, como o camundongo, pois os camundongos são amplamente utilizados em pesquisas de eletrofisiologia.
As principais partes do sistema de condução cardíaca são o nó sinoatrial (SAN), onde o impulso elétrico é gerado em células de marcapasso especializadas, e o nó atrioventricular (AVN), que é a única conexão elétrica entre os átrios e os ventrículos4. Sempre que as propriedades eletrofisiológicas da SAN e da AVN são alteradas, podem ocorrer arritmias como síndrome do seio doente ou bloqueio atrioventricular, o que pode levar à deterioração hemodinâmica, síncope e até mesmo à morte, ressaltando assim o papel essencial da SAN e da AVN na eletrofisiologia e arritmogênese5.
Estudos abrangentes sobre SAN ou AVN exigem uma localização e visualização precisas de ambas as estruturas, idealmente dentro de seu ambiente fisiológico. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e localização dentro do miocárdio de trabalho, sem estabelecer uma estrutura macroscopicamente visível clara, estudar a anatomia e a eletrofisiologia da SAN e da AVN é um desafio. Pontos de referência anatômicos podem ser usados para identificar aproximadamente a região que contém SAN e AVN 6,7,8. Em resumo, a SAN está localizada na região inter-caval do átrio direito adjacente à crista terminal muscular (TC), a AVN está localizada dentro do triângulo de Koch estabelecido pela valva tricúspide, o óstio do seio coronariano e o tendão de Todaro. Até agora, esses marcos anatômicos foram usados principalmente para localizar, remover e, em seguida, estudar SAN e AVN como estruturas individuais (por exemplo, pela histologia convencional). Para entender melhor a complexa eletrofisiologia da SAN e da AVN (por exemplo, efeitos regulatórios de células adjacentes do miocárdio em funcionamento), no entanto, é necessário estudar os sistemas de condução dentro do ambiente fisiológico 3D.
A coloração por imunofluorescência de montagem completa é um método utilizado para estudar estruturas anatômicas in situ , preservando a integridade do tecido circundante9. Aproveitando o software de microscopia confocal e análise de imagens, o SAN e o AVN podem ser visualizados com anticorpos marcados fluorescentemente visando canais iônicos especificamente expressos nessas regiões.
Este protocolo a seguir explica as etapas necessárias para executar um método de coloração de montagem completa bem estabelecido para localização e visualização de microscópio SAN e AVN. Especificamente, este protocolo descreve como (1) localizar SAN e AVN por marcos anatômicos para preparar essas amostras para coloração e análise microscópica (2) para realizar coloração de imunofluorescência de montagem completa dos marcadores de referência HCN4 e Cx43 (3) para preparar amostras de SAN e AVN para microscopia confocal (4) para realizar imagens confocais de SAN e AVN. Também descrevemos como este protocolo pode ser modificado para incluir coloração adicional do miocárdio circundante ou células não-miócitos, como fibras nervosas autônomas, o que permite uma investigação completa do sistema de condução cardíaca dentro do coração.
Protocol
Representative Results
Discussion
A anatomia cardíaca tem sido tradicionalmente estudada por meio de cortes histológicos finos11. No entanto, esses métodos não preservam a estrutura tridimensional do sistema de condução e, portanto, fornecem apenas informações 2D. O protocolo de coloração por imunofluorescência de montagem completa descrito aqui permite superar essas limitações e pode ser usado rotineiramente para imagens SAN e AVN.
Em comparação com métodos padrão, como a imuno-histoqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, para R. Xia), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 para S. Clauss, 81Z0600206 para S. Kääb), a Fundação Corona (S199/10079/2019 para S. Clauss), o SFB 914 (projeto Z01 para H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e projeto A10 para C. Schulz), o ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 para S. Clauss) e o Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (para S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
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