Иммунофлуоресцентное окрашивание, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция синоатриального и атриовентрикулярного узла у мыши
Summary
Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.
Abstract
Электрический сигнал, физиологически генерируемый клетками кардиостимулятора в синоатриальном узле (SAN), проводится через проводящую систему, которая включает в себя атриовентрикулярный узел (AVN), чтобы обеспечить возбуждение и сокращение всего сердца. Любая дисфункция SAN или AVN приводит к аритмиям, что указывает на их фундаментальную роль в электрофизиологии и аритмогенезе. Мышиные модели широко используются в исследованиях аритмии, но конкретное исследование SAN и AVN остается сложным.
SAN расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, а AVN расположен на вершине треугольника Коха, образованного отверстием коронарного синуса, трикуспидальным кольцом и сухожилием Тодаро. Однако из-за небольших размеров визуализация с помощью обычной гистологии остается сложной задачей и не позволяет изучать SAN и AVN в их 3D-среде.
Здесь мы описываем цельномонтный иммунофлуоресцентный подход, который позволяет локально визуализировать меченые мыши SAN и AVN. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание предназначено для небольших участков ткани без необходимости ручного сечения. С этой целью сердце мыши рассекают, удаляют нежелательные ткани с последующей фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой. Затем клетки проводящей системы внутри SAN и AVN окрашивают антителом против HCN4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и обработка изображений позволяют дифференцировать узловые клетки и работающие кардиомиоциты, а также четко локализовать SAN и AVN. Кроме того, дополнительные антитела могут быть объединены для маркировки других типов клеток, таких как нервные волокна.
По сравнению с традиционной иммуногистологией, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание сохраняет анатомическую целостность сердечной проводящей системы, что позволяет исследовать AVN; особенно в их анатомии и взаимодействиях с окружающими рабочими клетками миокарда и немиоцитарными клетками.
Introduction
Аритмии являются распространенными заболеваниями, поражающими миллионы людей, и являются причиной значительной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на огромные успехи в лечении и профилактике, такие как разработка кардиостимуляторов, лечение аритмий остается сложным, в первую очередь из-за очень ограниченных знаний о механизмах основного заболевания 1,2,3. Лучшее понимание как нормальной электрофизиологии, так и патофизиологии аритмий может помочь разработать новые, инновационные и причинно-следственные стратегии лечения в будущем. Кроме того, для всестороннего изучения аритмогенеза важно локализовать и визуализировать конкретную систему сердечной проводимости на животных моделях, таких как мыши, поскольку мыши широко используются в электрофизиологических исследованиях.
Основными частями системы сердечной проводимости являются синоатриальный узел (SAN), где электрический импульс генерируется в специализированных клетках кардиостимулятора, и атриовентрикулярный узел (AVN), который является единственным электрическим соединением между предсердиями и желудочками4. Всякий раз, когда электрофизиологические свойства SAN и AVN изменяются, могут возникать аритмии, такие как синдром больного синуса или атриовентрикулярная блокада, которые могут привести к ухудшению гемодинамики, обмороку и даже смерти, и, таким образом, подчеркнуть существенную роль как SAN, так и AVN в электрофизиологии и аритмогенезе5.
Комплексные исследования SAN или AVN требуют точной локализации и визуализации обеих структур, в идеале в их физиологической среде. Однако из-за их небольших размеров и расположения в пределах рабочего миокарда, без установления четкой макроскопически видимой структуры, изучение анатомии и электрофизиологии SAN и AVN является сложной задачей. Анатомические ориентиры могут быть использованы для приблизительной идентификации области, содержащей SAN и AVN 6,7,8. Короче говоря, SAN расположен в межкавалевой области правого предсердия, прилегающей к мышечной crista terminalis (CT), AVN расположен в треугольнике Коха, установленном трикуспидальным клапаном, остиумом коронарного синуса и сухожилием Тодаро. До сих пор эти анатомические ориентиры в основном использовались для локализации, удаления, а затем изучения SAN и AVN как отдельных структур (например, с помощью обычной гистологии). Однако для лучшего понимания сложной электрофизиологии SAN и AVN (например, регуляторных эффектов соседних клеток рабочего миокарда) необходимо изучение проводящих систем в физиологической 3D-среде.
Полноуровневое иммунофлуоресцентное окрашивание представляет собой метод, который используется для изучения анатомических структур in situ при сохранении целостности окружающих тканей9. Используя преимущества конфокальной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений, SAN и AVN могут быть визуализированы с флуоресцентно мечеными антителами, нацеленными на ионные каналы, специально выраженные в этих областях.
Этот следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения хорошо зарекомендовавшего себя метода окрашивания цельным креплением для локализации и визуализации микроскопов SAN и AVN. В частности, этот протокол описывает, как (1) локализовать SAN и AVN анатомическими ориентирами для подготовки этих образцов к окрашиванию и микроскопическому анализу (2) выполнить полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание эталонных маркеров HCN4 и Cx43 (3) для подготовки образцов SAN и AVN для конфокальной микроскопии (4) для выполнения конфокальной визуализации SAN и AVN. Мы также описываем, как этот протокол может быть модифицирован, чтобы включить дополнительное окрашивание окружающего рабочего миокарда или немиоцитарных клеток, таких как автономные нервные волокна, что позволяет тщательно исследовать систему сердечной проводимости в сердце.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анатомия сердца традиционно изучается с использованием тонких гистологических срезов11. Однако эти методы не сохраняют трехмерную структуру проводящей системы и, таким образом, предоставляют только 2D-информацию. Описанный здесь протокол иммунофлуоресцентного окрашиван?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb), Фондом Короны (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для H. Ishikawa-Ankerhold и S. Massberg и проект A10 для C. Schulz), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
