צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר
Summary
אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלבבות מורין.
Abstract
האות החשמלי שנוצר פיזיולוגית על ידי תאי קוצב לב בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מתבצע דרך מערכת ההולכה, הכוללת את הצומת האטריובנטריקולרי (AVN), כדי לאפשר עירור והתכווצות של הלב כולו. כל תפקוד לקוי של SAN או AVN גורם להפרעות קצב, דבר המצביע על תפקידן הבסיסי באלקטרופיזיולוגיה והפרעות קצב. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הפרעות קצב, אך החקירה הספציפית של SAN ו- AVN נותרה מאתגרת.
ה- SAN ממוקם בצומת של מסוף הקריסטה עם הווריד הנבוב העליון ו- AVN ממוקם בקודקוד המשולש של קוך, שנוצר על ידי פתח הסינוס הכלילי, הטבעת הטריקוספידית והגיד של טודרו. עם זאת, בשל הגודל הקטן, הדמיה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית נותרה מאתגרת והיא אינה מאפשרת את המחקר של SAN ו- AVN בסביבת התלת-ממד שלהם.
כאן אנו מתארים גישה אימונופלואורסצנטית של הר שלם המאפשרת הדמיה מקומית של SAN ו- AVN של עכבר מתויג. צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה מיועדת למקטעים קטנים יותר של רקמה ללא צורך בחתך ידני. לשם כך, לב העכבר מנותח, עם רקמות לא רצויות הוסרו, ואחריו קיבוע, חדירה וחסימה. תאים של מערכת ההולכה בתוך SAN ו-AVN מוכתמים בנוגדן אנטי-HCN4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ועיבוד תמונה מאפשרים התמיינות בין תאי קשרית לבין קרדיומיוציטים עובדים, ולמקם בבירור SAN ו- AVN. יתר על כן, ניתן לשלב נוגדנים נוספים כדי לסמן גם סוגי תאים אחרים, כגון סיבי עצב.
בהשוואה לאימונוהיסטולוגיה קונבנציונלית, צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה שומרת על השלמות האנטומית של מערכת הולכת הלב, ובכך מאפשרת חקירה של AVN; במיוחד כך לתוך האנטומיה שלהם ואת האינטראקציות עם שריר הלב עובד שמסביב תאים שאינם מיוציטים.
Introduction
הפרעות קצב הן מחלות שכיחות הפוגעות במיליוני אנשים, והן גורמות לתחלואה ותמותה משמעותיות ברחבי העולם. למרות התקדמות עצומה בטיפול ובמניעה, כגון פיתוח קוצבי לב, הטיפול בהפרעות קצב נותר מאתגר, בעיקר בשל הידע המוגבל מאוד לגבי מנגנוני המחלה הבסיסיים 1,2,3. הבנה טובה יותר הן של האלקטרופיזיולוגיה הרגילה והן של הפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשניות, חדשניות וסיבתיות בעתיד. בנוסף, כדי לחקור באופן מקיף הפרעות קצב, חשוב למקם ולדמיין את מערכת הולכת הלב הספציפית במודלים של בעלי חיים כגון עכבר, שכן עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אלקטרופיזיולוגי.
החלקים העיקריים של מערכת ההולכה הלבבית הם הצומת הסינואפרוזדורי (SAN), שבו נוצר הדחף החשמלי בתאי קוצב מיוחדים, והצומת האטריובנטריקולרי (AVN), שהוא החיבור החשמלי היחיד בין האטריה לחדרים4. בכל פעם שהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של SAN ו- AVN משתנות, הפרעות קצב כגון תסמונת סינוס חולה או בלוק אטריובנטריקולרי יכולות להתרחש אשר עלולות להוביל להידרדרות המודינמית, סינקופה ואפילו מוות, ובכך להדגיש את התפקיד החיוני של SAN ו- AVN הן באלקטרופיזיולוגיה והן בהפרעות קצב5.
מחקרים מקיפים על SAN או AVN דורשים לוקליזציה מדויקת והדמיה של שני המבנים, באופן אידיאלי בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, בשל גודלם הקטן ומיקומם בתוך שריר הלב העובד, מבלי לקבוע מבנה ברור הנראה לעין מבחינה מקרוסקופית, חקר האנטומיה והאלקטרופיזיולוגיה של SAN ו- AVN הוא מאתגר. ניתן להשתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לזהות בערך את האזור המכיל SAN ו- AVN 6,7,8. בקצרה, SAN ממוקם באזור הבין-קוואלי של האטריום הימני הסמוך למסוף הקריסטה השרירי (CT), AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך שהוקם על ידי המסתם הטריקוספיד, האוסטיום של הסינוס הכלילי והגיד של טודרו. עד כה, ציוני דרך אנטומיים אלה שימשו בעיקר כדי למקם, להסיר ולאחר מכן לחקור SAN ו- AVN כמבנים בודדים (למשל, על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית). עם זאת, כדי להבין טוב יותר את האלקטרופיזיולוגיה המורכבת של SAN ו-AVN (למשל, השפעות רגולטוריות של תאים סמוכים של שריר הלב העובד), יש צורך לחקור את מערכות ההולכה בסביבה הפיזיולוגית התלת-ממדית.
צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה היא שיטה המשמשת לחקר מבנים אנטומיים באתרם תוך שמירה על שלמות הרקמה שמסביב9. באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה לניתוח תמונה, ניתן להמחיש SAN ו-AVN באמצעות נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי המכוונים לתעלות יונים המבוטאות באופן ספציפי באזורים אלה.
פרוטוקול זה להלן מסביר את השלבים הדרושים לביצוע שיטת צביעה מבוססת היטב להרכבה מלאה עבור לוקליזציה והדמיה של מיקרוסקופ SAN ו- AVN. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) למקם SAN ו- AVN לפי ציוני דרך אנטומיים כדי להכין דגימות אלה לצביעה ולניתוח מיקרוסקופיה (2) לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה של סמני הייחוס HCN4 ו- Cx43 (3) להכין דגימות SAN ו- AVN למיקרוסקופ קונפוקלי (4) לביצוע הדמיה קונפוקלית של SAN ו- AVN. אנו גם מתארים כיצד ניתן לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול צביעה נוספת של שריר הלב העובד שמסביב או תאים שאינם מיוציטים כגון סיבי עצב אוטונומיים המאפשרים חקירה יסודית של מערכת הולכת הלב בתוך הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנטומיה של הלב נחקרה באופן מסורתי באמצעות חתכים היסטולוגיים דקים11. עם זאת, שיטות אלה אינן משמרות את המבנה התלת מימדי של מערכת ההולכה ולכן מספקות מידע דו-ממדי בלבד. פרוטוקול צביעת האימונופלואורסנציה המתואר כאן מאפשר להתגבר על מגבלות אלה וניתן להשתמש בו באופן שגרתי להדמיית SAN ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל R. Xia), המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם (DZHK; 81X2600255 ל S. Clauss, 81Z0600206 ל S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל H. Ishikawa-Ankerhold ו S. Massberg ופרויקט A10 ל C. Schulz), ERA-NET על מחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל S. Clauss) ואת קרן Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl (ל S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
