マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成
Summary
マウス心臓の洞房結節(SAN)と房室結節(AVN)のホールマウント免疫蛍光染色のための段階的なプロトコルを提供します。
Abstract
洞房結節(SAN)のペースメーカー細胞によって生理学的に生成された電気信号は、房室結節(AVN)を含む伝導系を介して伝導され、心臓全体の興奮と収縮を可能にします。SANまたはAVNのいずれかの機能不全は不整脈を引き起こし、電気生理学および不整脈形成におけるそれらの基本的な役割を示しています。マウスモデルは不整脈の研究に広く使用されていますが、SANとAVNの具体的な調査は依然として困難です。
SANはクリスタターミナルと上大静脈の接合部に位置し、AVNは冠状静脈洞の開口部、三尖弁輪、およびトダロの腱によって形成されるコッホの三角形の頂点に位置する。しかし、サイズが小さいため、従来の組織学による可視化は依然として困難であり、3D環境内でのSANおよびAVNの研究はできません。
ここでは、標識マウスSANおよびAVNの局所可視化を可能にするホールマウント免疫蛍光法について説明します。 ホールマウント免疫蛍光染色は、手動切片を必要とせずに、組織のより小さな切片を対象としています。この目的のために、マウスの心臓を解剖し、不要な組織を取り除き、続いて固定、透過処理および遮断する。次に、SANおよびAVN内の伝導系の細胞を抗HCN4抗体で染色します。共焦点レーザー走査型顕微鏡と画像処理により、リンパ節細胞と作動心筋細胞を区別し、SANとAVNを明確に局在化することができます。さらに、追加の抗体を組み合わせて、神経線維などの他の細胞型も標識することができます。
従来の免疫組織学と比較して、ホールマウント免疫蛍光染色は心臓伝導系の解剖学的完全性を維持し、AVNの調査を可能にします。特に、それらの解剖学的構造および周囲の作業心筋および非筋細胞との相互作用にそうである。
Introduction
不整脈は何百万人もの人々に影響を与える一般的な病気であり、世界中で重大な罹患率と死亡率の原因となっています。心臓ペースメーカーの開発など、治療と予防の大幅な進歩にもかかわらず、主に基礎疾患メカニズムに関する知識が非常に限られているため、不整脈の治療は依然として困難です1,2,3。不整脈の正常な電気生理学と病態生理学の両方をよりよく理解することは、将来の新規で革新的で因果関係のある治療戦略の開発に役立つ可能性があります。また、不整脈形成を包括的に研究するためには、マウスが電気生理学研究で広く用いられているため、マウスなどの動物モデルにおいて特異的な心臓伝導系を局在化・可視化することが重要です。
心臓伝導系の主要部分は、特殊なペースメーカー細胞で電気インパルスが発生する洞房結節(SAN)と、心房と心室の間の唯一の電気的接続である房室結節(AVN)です4。SANとAVNの電気生理学的特性が変化するたびに、洞不全症候群や房室ブロックなどの不整脈が発生し、血行力学的悪化、失神、さらには死に至る可能性があり、電気生理学と不整脈形成におけるSANとAVNの両方の本質的な役割を強調しています5。
SANまたはAVNに関する包括的な研究では、理想的には生理学的環境内で、両方の構造の正確な位置特定と視覚化が必要です。しかし、作業心筋内のサイズと位置が小さいため、肉眼的にはっきりと見える構造を確立することなく、SANとAVNの解剖学と電気生理学を研究することは困難です。解剖学的ランドマークを使用して、SAN および AVN6、7、8 を含むリージョンを大まかに識別できます。簡単に言えば、SANは筋クリスタターミナル(CT)に隣接する右心房の騎骨間領域に位置し、AVNは三尖弁、冠状静脈洞の口、およびトダロの腱によって確立されたコッホの三角形内に位置する。これまで、これらの解剖学的ランドマークは、主にSANとAVNを個々の構造として(従来の組織学などによって)局在化、除去、および研究するために使用されていました。しかし、SANとAVNの複雑な電気生理学(例えば、作動心筋の隣接細胞の調節効果)をよりよく理解するためには、生理学的3D環境内の伝導系を研究する必要があります。
ホールマウント免疫蛍光染色は、周囲の組織の完全性を維持しながら、 その場で 解剖学的構造を研究するために使用される方法です9。共焦点顕微鏡と画像解析ソフトウェアを利用して、SANおよびAVNは、これらの領域に特異的に発現するイオンチャネルを標的とする蛍光標識抗体で視覚化できます。
このプロトコルでは、SANおよびAVN顕微鏡の局在化と可視化のために確立されたホールマウント染色法を実行するために必要な手順について説明します。具体的には、このプロトコルは、(1)解剖学的ランドマークによってSANおよびAVNを局在化して、染色および顕微鏡分析のためにこれらのサンプルを準備する方法(2)参照マーカーHCN4およびCx43のホールマウント免疫蛍光染色を実行する方法(3)共焦点顕微鏡用のSANおよびAVNサンプルを調製する方法(4)SANおよびAVNの共焦点イメージングを実行する方法を説明する。また、このプロトコルを変更して、周囲の働く心筋または自律神経線維などの非筋細胞の追加染色を含めて、心臓内の心臓伝導系の徹底的な調査を可能にする方法についても説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
心臓の解剖学は伝統的に薄い組織学的切片を使用して研究されてきました11。ただし、これらの方法は伝導システムの3次元構造を保持しないため、2D情報のみを提供します。ここで説明するホールマウント免疫蛍光染色プロトコルは、これらの制限を克服することを可能にし、SANおよびAVNイメージングに日常的に使用することができます。
パラフィン包…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国奨学金評議会(CSC、R.Xia)、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK、81X2600255からS.クラウス、81Z0600206からS.カエブ)、コロナ財団(S199/10079/2019からS.クラウス)、SFB 914(プロジェクトZ01から石川-アンカーホールドとS.マスバーグ、プロジェクトA10からC.シュルツ)、心血管疾患に関するERA-NET(ERA-CVD、01KL1910からS.クラウス)、ハインリッヒアンドロッテミュールフェンツル財団(S.クラウス)によってサポートされました。資金提供者は原稿の準備に何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
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