Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu
Summary
Murin kalplerde sinoatriyal nod (SAN) ve atriyoventriküler nodun (AVN) tam montajlı immünofloresan boyaması için adım adım bir protokol sağlıyoruz.
Abstract
Sinoatriyal düğümdeki (SAN) kalp pili hücreleri tarafından fizyolojik olarak üretilen elektrik sinyali, tüm kalbin uyarılmasına ve kasılmasına izin vermek için atriyoventriküler düğümü (AVN) içeren iletim sistemi aracılığıyla iletilir. SAN veya AVN’nin herhangi bir disfonksiyonu, elektrofizyoloji ve aritmogenezdeki temel rollerini gösteren aritmilere neden olur. Fare modelleri aritmi araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak SAN ve AVN’nin spesifik araştırması zor olmaya devam etmektedir.
SAN, crista terminalinin superior vena kava ile birleştiği noktada bulunur ve AVN, koroner sinüs, triküspid annulus ve Todaro tendonunun deliğinden oluşan Koch üçgeninin tepesinde bulunur. Bununla birlikte, küçük boyut nedeniyle, geleneksel histoloji ile görselleştirme zor olmaya devam etmektedir ve SAN ve AVN’nin 3D ortamlarında incelenmesine izin vermemektedir.
Burada, etiketli fare SAN ve AVN’nin yerel olarak görselleştirilmesine izin veren tam montajlı bir immünofloresan yaklaşımını açıklıyoruz. Bu amaçla, fare kalbi disseke edilir, istenmeyen doku çıkarılır, ardından fiksasyon, geçirgenlik ve bloke edilir. SAN ve AVN içindeki iletim sisteminin hücreleri daha sonra bir anti-HCN4 antikoru ile boyanır. Konfokal lazer tarama mikroskobu ve görüntü işleme, düğüm hücreleri ve çalışan kardiyomiyositler arasında ayrım yapılmasına ve SAN ve AVN’nin net bir şekilde lokalize edilmesine izin verir. Ayrıca, sinir lifleri gibi diğer hücre tiplerini de etiketlemek için ek antikorlar birleştirilebilir.
Konvansiyonel immünohistoloji ile karşılaştırıldığında, tam montajlı immünofloresan boyama, kardiyak iletim sisteminin anatomik bütünlüğünü korur, böylece AVN’nin araştırılmasına izin verir; özellikle anatomilerine ve çevredeki çalışan miyokard ve miyosit olmayan hücrelerle etkileşimlerine girer.
Introduction
Aritmiler milyonlarca insanı etkileyen yaygın hastalıklardır ve dünya çapında önemli morbidite ve mortalite nedenidir. Kardiyak kalp pillerinin geliştirilmesi gibi tedavi ve önlemedeki muazzam ilerlemelere rağmen, aritmilerin tedavisi, esas olarak altta yatan hastalık mekanizmaları hakkındaki çok sınırlı bilgi birikimi nedeniyle zor olmaya devam etmektedir 1,2,3. Aritmilerin hem normal elektrofizyolojisinin hem de patofizyolojisinin daha iyi anlaşılması, gelecekte yeni, yenilikçi ve nedensel tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, aritmogenezi kapsamlı bir şekilde incelemek için, fareler elektrofizyoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığından, fare gibi hayvan modellerinde spesifik kardiyak iletim sistemini lokalize etmek ve görselleştirmek önemlidir.
Kardiyak iletim sisteminin ana parçaları, elektriksel impulsun özel kalp pili hücrelerinde üretildiği sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyum ile ventriküller arasındaki tek elektriksel bağlantı olan atriyoventriküler düğümdür (AVN)4. SAN ve AVN’nin elektrofizyolojik özellikleri her değiştiğinde, hemodinamik bozulmaya, senkopa ve hatta ölüme yol açabilecek hasta sinüs sendromu veya atriyoventriküler blok gibi aritmiler ortaya çıkabilir ve böylece hem SAN hem de AVN’nin elektrofizyoloji ve aritmiyogenezdeki temel rolünün altını çizer5.
SAN veya AVN ile ilgili kapsamlı çalışmalar, her iki yapının da ideal olarak fizyolojik ortamlarında hassas bir lokalizasyonunu ve görselleştirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, çalışan miyokard içindeki küçük boyutları ve konumları nedeniyle, makroskopik olarak görülebilen net bir yapı oluşturmadan, SAN ve AVN’nin anatomisini ve elektrofizyolojisini incelemek zordur. Anatomik yer işaretleri, SAN ve AVN 6,7,8’i içeren bölgeyi kabaca tanımlamak için kullanılabilir. Kısaca SAN, sağ atriyumun kas krista terminalisine (BT) bitişik kaval bölgesinde, AVN, triküspid kapak, koroner sinüsün ostiumu ve Todaro tendonu tarafından kurulan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Şimdiye kadar, bu anatomik işaretler esas olarak SAN ve AVN’yi bireysel yapılar olarak lokalize etmek, kaldırmak ve daha sonra incelemek için kullanıldı (örneğin, geleneksel histoloji ile). Bununla birlikte, SAN ve AVN’nin karmaşık elektrofizyolojisini (örneğin, çalışan miyokardın bitişik hücrelerinin düzenleyici etkileri) daha iyi anlamak için, fizyolojik 3D ortamdaki iletim sistemlerini incelemek gereklidir.
Tam montajlı immünofloresan boyama, çevreleyen dokunun bütünlüğünü korurken anatomik yapıları in situ olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir9. Konfokal mikroskopi ve görüntü analiz yazılımından yararlanan SAN ve AVN, özellikle bu bölgelerde ifade edilen iyon kanallarını hedefleyen floresan etiketli antikorlarla görselleştirilebilir.
Aşağıdaki protokol, SAN ve AVN mikroskop lokalizasyonu ve görselleştirmesi için iyi kurulmuş bir bütüne monte boyama yöntemi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklamaktadır. Spesifik olarak, bu protokol (1) SAN ve AVN’nin anatomik işaretlerle anatomik işaretlerle nasıl lokalize edileceğini ve bu numunelerin boyama ve mikroskopi analizi için nasıl lokalize edileceğini (2) HCN4 ve Cx43 (3) referans belirteçlerinin tam montajlı immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek için SAN ve AVN örneklerini konfokal mikroskopi için hazırlamak (4) SAN ve AVN’nin konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için açıklamaktadır. Ayrıca, bu protokolün, çevredeki çalışan miyokard veya otonom sinir lifleri gibi miyosit olmayan hücrelerin ilave boyanmasını içerecek şekilde nasıl değiştirilebileceğini de açıklıyoruz, bu da kalp içindeki kardiyak iletim sisteminin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiyak anatomi geleneksel olarak ince histolojik kesitler11 kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler iletim sisteminin üç boyutlu yapısını korumaz ve bu nedenle sadece 2D bilgi sağlar. Burada açıklanan tam montajlı immünofloresan boyama protokolü bu sınırlamaların üstesinden gelmeye izin verir ve SAN ve AVN görüntüleme için rutin olarak kullanılabilir.
Parafin gömme, kesitleme ve antijen alımı gerektiren geleneksel immünohi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia’ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255’ten S. Clauss’a, 81Z0600206’dan S. Kääb’a), Corona Vakfı (S199/10079/2019’dan S. Clauss’a), SFB 914 (H. Ishikawa-Ankerhold ve S. Massberg’e Z01 projesi ve A10’dan C. Schulz’a), Kardiyovasküler Hastalıklar üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910’dan S. Clauss’a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss’a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
