Helmonterad immunofluorescensfärgning, konfokal avbildning och 3D-rekonstruktion av den sinoatriella och atrioventrikulära noden i musen
Summary
Vi tillhandahåller ett steg-för-steg-protokoll för helmonterad immunofluorescensfärgning av sinoatriell nod (SAN) och atrioventrikulär nod (AVN) i murina hjärtan.
Abstract
Den elektriska signalen som fysiologiskt genereras av pacemakerceller i den sinoatriella noden (SAN) leds genom ledningssystemet, vilket inkluderar den atrioventrikulära noden (AVN), för att möjliggöra excitation och sammandragning av hela hjärtat. Eventuell dysfunktion av antingen SAN eller AVN resulterar i arytmier, vilket indikerar deras grundläggande roll i elektrofysiologi och arytmogenes. Musmodeller används ofta inom arytmiforskning, men den specifika undersökningen av SAN och AVN är fortfarande utmanande.
SAN ligger vid korsningen av crista terminalis med överlägsen vena cava och AVN ligger vid toppen av triangeln Koch, bildad av öppningen av koronar sinus, tricuspid annulus och senan i Todaro. På grund av den lilla storleken är visualisering med konventionell histologi fortfarande utmanande och det tillåter inte studier av SAN och AVN inom deras 3D-miljö.
Här beskriver vi en helmonterad immunofluorescensmetod som möjliggör lokal visualisering av märkt mus SAN och AVN. Helmonterad immunofluorescensfärgning är avsedd för mindre delar av vävnad utan behov av manuell sektionering. För detta ändamål dissekeras mushjärtat, med oönskad vävnad borttagen, följt av fixering, permeabilisering och blockering. Celler i ledningssystemet inom SAN och AVN färgas sedan med en anti-HCN4-antikropp. Konfokal laserskanningsmikroskopi och bildbehandling möjliggör differentiering mellan nodala celler och fungerande kardiomyocyter och att tydligt lokalisera SAN och AVN. Dessutom kan ytterligare antikroppar kombineras för att märka andra celltyper, såsom nervfibrer.
Jämfört med konventionell immunohistologi bevarar helmonterad immunofluorescensfärgning den anatomiska integriteten hos hjärtledningssystemet, vilket möjliggör undersökning av AVN; speciellt så i deras anatomi och interaktioner med de omgivande arbetande myokardium- och icke-myocytcellerna.
Introduction
Arytmier är vanliga sjukdomar som drabbar miljontals människor och orsakar betydande sjuklighet och dödlighet över hela världen. Trots enorma framsteg inom behandling och prevention, såsom utveckling av pacemakers, är behandling av arytmier fortfarande utmanande, främst på grund av den mycket begränsade kunskapen om underliggande sjukdomsmekanismer 1,2,3. En bättre förståelse för både normal elektrofysiologi och patofysiologi av arytmier kan bidra till att utveckla nya, innovativa och kausala behandlingsstrategier i framtiden. För att omfattande studera arytmogenes är det dessutom viktigt att lokalisera och visualisera det specifika hjärtledningssystemet i djurmodeller som musen, eftersom möss används ofta inom elektrofysiologisk forskning.
De viktigaste delarna av hjärtledningssystemet är den sinoatriella noden (SAN), där den elektriska impulsen genereras i specialiserade pacemakerceller, och den atrioventrikulära noden (AVN), som är den enda elektriska förbindelsen mellan förmaken och ventriklerna4. När de elektrofysiologiska egenskaperna hos SAN och AVN förändras kan arytmier såsom sick sinus syndrom eller atrioventrikulärt block uppstå, vilket kan leda till hemodynamisk försämring, synkope och till och med död, och därmed understryka den väsentliga rollen för både SAN och AVN i elektrofysiologi och arytmogenes5.
Omfattande studier av SAN eller AVN kräver en exakt lokalisering och visualisering av båda strukturerna, helst inom deras fysiologiska miljö. Men på grund av deras lilla storlek och placering inom arbetsmyokardiet, utan att skapa en tydlig makroskopiskt synlig struktur, är det utmanande att studera anatomi och elektrofysiologi hos SAN och AVN. Anatomiska landmärken kan användas för att grovt identifiera regionen som innehåller SAN och AVN 6,7,8. I korthet ligger SAN i mellankavalregionen i det högra atriumet intill den muskulära crista terminalis (CT), AVN ligger inom triangeln Koch etablerad av tricuspidventilen, ostium i koronar sinus och senan i Todaro. Hittills har dessa anatomiska landmärken huvudsakligen använts för att lokalisera, ta bort och sedan studera SAN och AVN som enskilda strukturer (t.ex. genom konventionell histologi). För att bättre förstå den komplexa elektrofysiologin hos SAN och AVN (t.ex. reglerande effekter av intilliggande celler i arbetsmyokardiet) är det dock nödvändigt att studera ledningssystemen inom den fysiologiska 3D-miljön.
Helmonterad immunofluorescensfärgning är en metod som används för att studera anatomiska strukturer in situ samtidigt som integriteten hos den omgivande vävnaden bevaras9. Med hjälp av programvara för konfokalmikroskopi och bildanalys kan SAN och AVN visualiseras med fluorescerande märkta antikroppar riktade mot jonkanaler specifikt uttryckta i dessa regioner.
Följande protokoll förklarar de nödvändiga stegen för att utföra en väletablerad helmonterad färgningsmetod för lokalisering och visualisering av SAN- och AVN-mikroskop. Specifikt beskriver detta protokoll hur (1) att lokalisera SAN och AVN genom anatomiska landmärken för att förbereda dessa prover för färgning och mikroskopianalys (2) att utföra helmonterad immunofluorescensfärgning av referensmarkörerna HCN4 och Cx43 (3) för att förbereda SAN- och AVN-prover för konfokalmikroskopi (4) för att utföra konfokal avbildning av SAN och AVN. Vi beskriver också hur detta protokoll kan modifieras för att inkludera ytterligare färgning av omgivande fungerande myokardium- eller icke-myocytceller, såsom autonoma nervfibrer, vilket möjliggör en grundlig undersökning av hjärtledningssystemet i hjärtat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjärtats anatomi har traditionellt studerats med hjälp av tunna histologiska avsnitt11. Dessa metoder bevarar emellertid inte ledningssystemets tredimensionella struktur och ger därför endast 2D-information. Det helmonterade immunofluorescensfärgningsprotokollet som beskrivs här gör det möjligt att övervinna dessa begränsningar och kan rutinmässigt användas för SAN- och AVN-avbildning.
I jämförelse med standardmetoder som konventionell immunhistokemi som …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av China Scholarship Council (CSC, till R. Xia), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss, 81Z0600206 till S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 till H. Ishikawa-Ankerhold och S. Massberg och projekt A10 till C. Schulz), ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss) och Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptberedningen.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
