Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis
Summary
We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.
Abstract
Het elektrische signaal dat fysiologisch wordt gegenereerd door pacemakercellen in de sinoatriale knoop (SAN) wordt geleid door het geleidingssysteem, dat de atrioventriculaire knoop (AVN) omvat, om excitatie en contractie van het hele hart mogelijk te maken. Elke disfunctie van SAN of AVN resulteert in aritmieën, wat wijst op hun fundamentele rol in elektrofysiologie en aritmogenese. Muismodellen worden veel gebruikt in aritmieonderzoek, maar het specifieke onderzoek naar SAN en AVN blijft een uitdaging.
Het SAN bevindt zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava en AVN bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch, gevormd door de opening van de coronaire sinus, de tricuspidalis annulus en de pees van Todaro. Vanwege het kleine formaat blijft visualisatie door conventionele histologie echter een uitdaging en het maakt de studie van SAN en AVN binnen hun 3D-omgeving niet mogelijk.
Hier beschrijven we een immunofluorescentiebenadering met volledige mount die de lokale visualisatie van gelabelde muis SAN en AVN mogelijk maakt. Whole-mount immunofluorescentiekleuring is bedoeld voor kleinere delen van weefsel zonder de noodzaak van handmatige secties. Daartoe wordt het muizenhart ontleed, waarbij ongewenst weefsel wordt verwijderd, gevolgd door fixatie, permeabilisatie en blokkering. Cellen van het geleidingssysteem binnen SAN en AVN worden vervolgens gekleurd met een anti-HCN4-antilichaam. Confocale laserscanmicroscopie en beeldverwerking maken differentiatie mogelijk tussen knooppuntcellen en werkende cardiomyocyten en kunnen SAN en AVN duidelijk lokaliseren. Bovendien kunnen extra antilichamen worden gecombineerd om ook andere celtypen te labelen, zoals zenuwvezels.
In vergelijking met conventionele immunohistologie behoudt immunofluorescentiekleuring van de hele montering de anatomische integriteit van het hartgeleidingssysteem, waardoor het onderzoek van AVN mogelijk is; vooral in hun anatomie en interacties met de omringende werkende myocardium en niet-myocytencellen.
Introduction
Aritmieën zijn veel voorkomende ziekten die miljoenen mensen treffen en zijn de oorzaak van aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Ondanks enorme vooruitgang in behandeling en preventie, zoals de ontwikkeling van pacemakers, blijft de behandeling van aritmieën een uitdaging, voornamelijk vanwege de zeer beperkte kennis over onderliggende ziektemechanismen 1,2,3. Een beter begrip van zowel de normale elektrofysiologie als de pathofysiologie van aritmieën kan helpen om in de toekomst nieuwe, innovatieve en causale behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Om aritmogenese uitgebreid te bestuderen, is het bovendien belangrijk om het specifieke hartgeleidingssysteem in diermodellen zoals de muis te lokaliseren en te visualiseren, omdat muizen veel worden gebruikt in elektrofysiologisch onderzoek.
De belangrijkste onderdelen van het hartgeleidingssysteem zijn de sinoatriale knoop (SAN), waar de elektrische impuls wordt gegenereerd in gespecialiseerde pacemakercellen, en de atrioventriculaire knoop (AVN), de enige elektrische verbinding tussen de boezems en de ventrikels4. Wanneer de elektrofysiologische eigenschappen van SAN en AVN worden gewijzigd, kunnen aritmieën zoals sick sinus syndroom of atrioventriculaire blok optreden die kunnen leiden tot hemodynamische achteruitgang, syncope en zelfs de dood, en zo de essentiële rol van zowel SAN als AVN in elektrofysiologie en aritmogenese onderstrepen5.
Uitgebreide studies over SAN of AVN vereisen een nauwkeurige lokalisatie en visualisatie van beide structuren, idealiter binnen hun fysiologische omgeving. Vanwege hun kleine omvang en locatie binnen het werkende myocardium, zonder een duidelijke macroscopisch zichtbare structuur vast te stellen, is het bestuderen van de anatomie en elektrofysiologie van SAN en AVN echter een uitdaging. Anatomische oriëntatiepunten kunnen worden gebruikt om ruwweg het gebied te identificeren dat SAN en AVN 6,7,8 bevat. Kortom, SAN bevindt zich in het inter-cavalgebied van het rechter atrium naast de musculaire crista terminalis (CT), AVN bevindt zich in de driehoek van Koch die wordt gevormd door de tricuspidalisklep, het ostium van de coronaire sinus en de pees van Todaro. Tot nu toe werden deze anatomische oriëntatiepunten voornamelijk gebruikt om SAN en AVN als individuele structuren te lokaliseren, te verwijderen en vervolgens te bestuderen (bijvoorbeeld door conventionele histologie). Om de complexe elektrofysiologie van SAN en AVN (bijv. Regulerende effecten van aangrenzende cellen van het werkende myocardium) beter te begrijpen, is het echter noodzakelijk om de geleidingssystemen binnen de fysiologische 3D-omgeving te bestuderen.
Immunofluorescentiekleuring met volledige mount is een methode die wordt gebruikt om anatomische structuren in situ te bestuderen met behoud van de integriteit van het omliggende weefsel9. Gebruikmakend van confocale microscopie- en beeldanalysesoftware, kunnen SAN en AVN worden gevisualiseerd met fluorescerend gelabelde antilichamen die gericht zijn op ionkanalen die specifiek in deze regio’s tot expressie komen.
In dit volgende protocol worden de noodzakelijke stappen uitgelegd om een gevestigde kleuringsmethode voor de hele montage uit te voeren voor SAN- en AVN-microscooplokalisatie en -visualisatie. In het bijzonder beschrijft dit protocol hoe (1) SAN en AVN moeten worden gelokaliseerd door anatomische oriëntatiepunten om deze monsters voor te bereiden op kleuring en microscopieanalyse (2) om immunofluorescentiekleuring van de referentiemarkers HCN4 en Cx43 uit te voeren (3) om SAN- en AVN-monsters voor te bereiden voor confocale microscopie (4) om confocale beeldvorming van SAN en AVN uit te voeren. We beschrijven ook hoe dit protocol kan worden aangepast om extra kleuring van omringend werkend myocardium of niet-myocytencellen zoals autonome zenuwvezels op te nemen, wat een grondig onderzoek van het hartgeleidingssysteem in het hart mogelijk maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cardiale anatomie is van oudsher bestudeerd met behulp van dunne histologische secties11. Deze methoden behouden echter niet de driedimensionale structuur van het geleidingssysteem en bieden dus alleen 2D-informatie. Het hier beschreven immunofluorescentiekleuringsprotocol met volledige mount maakt het mogelijk om deze beperkingen te overwinnen en kan routinematig worden gebruikt voor SAN- en AVN-beeldvorming.
In vergelijking met standaardmethoden zoals conventionele im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 tot H. Ishikawa-Ankerhold en S. Massberg en project A10 tot C. Schulz), het ERA-NET over hart- en vaatziekten (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-en-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
