Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Summary

Presentiamo un protocollo per l’identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l’uno dall’altro.

Abstract

La metabolomica è una metodologia utilizzata per l’identificazione e la quantificazione di molti intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo all’interno di una cellula, tessuto, organo, fluido biologico o organismo. La metabolomica si concentra tradizionalmente sui metaboliti solubili in acqua. Il metaboloma solubile in acqua è il prodotto finale di una complessa rete cellulare che integra vari fattori genomici, epigenomici, trascrittomici, proteomici e ambientali. Quindi, l’analisi metabolomica valuta direttamente l’esito dell’azione per tutti questi fattori in una pletora di processi biologici all’interno di vari organismi. Uno di questi organismi è il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, un eucariota unicellulare con il genoma completamente sequenziato. Poiché S. cerevisiae è suscettibile di analisi molecolari complete, viene utilizzato come modello per sezionare i meccanismi alla base di molti processi biologici all’interno della cellula eucariotica. Un metodo analitico versatile per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata del metaboloma solubile in acqua fornirebbe la metodologia essenziale per sezionare questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per le condizioni ottimizzate di tempra dell’attività metabolica e l’estrazione di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di S. cerevisiae. Il protocollo descrive anche l’uso della cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l’analisi quantitativa dei metaboliti idrosolubili estratti. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata qui descritto è versatile e robusto. Consente l’identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche, tra cui diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata è sensibile e consente l’identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. Il metodo è stato utilizzato con successo per valutare i metabolomi idrosolubili di cellule di lievito selvatiche e mutanti coltivate in condizioni diverse.

Introduction

I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell’espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l’autofagia, l’invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata^1,2,3.

Molti di questi ruoli essenziali dei metaboliti idrosolubili sono stati scoperti da studi nel lievito in erba S. cerevisiae^{1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Questo eucariota unicellulare è un organismo modello utile per i meccanismi di dissezione attraverso i quali i metaboliti idrosolubili contribuiscono ai processi cellulari grazie alla sua suscettibilità ad analisi biochimiche, genetiche e biologiche molecolari avanzate^23,24,25,26. Sebbene i metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata siano stati utilizzati per studiare i ruoli dei metaboliti idrosolubili nel lievito in erba^3,18,22,27,questo tipo di analisi richiede il miglioramento della sua versatilità, robustezza, sensibilità e capacità di distinguere tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti.

Gli ultimi anni sono caratterizzati da progressi significativi nell’applicazione dei metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata alla profilazione di metaboliti idrosolubili in vivo. Tuttavia, molte sfide nell’utilizzo di questa metodologia rimangono^{2,28, 29,30,31,32,33,34,35,36.} Queste sfide includono quanto segue. In primo luogo, le concentrazioni intracellulari di molti metaboliti solubili in acqua sono al di sotto di una soglia di sensibilità per i metodi attualmente utilizzati. In secondo luogo, l’efficienza della tempra dell’attività metabolica è troppo bassa e l’entità della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari è troppo alta per i metodi attuali; quindi, i metodi attualmente utilizzati sottostivalutano le concentrazioni intracellulari dei metaboliti idrosolubili. In terzo luogo, i metodi esistenti non possono differenziare gli isomeri strutturali (cioè molecole con la stessa formula chimica ma diversa connettività atomica) o stereoisomeri (cioè molecole con la stessa formula chimica e connettività atomica, ma con la diversa disposizione atomica nello spazio) di metaboliti specifici; ciò impedisce la corretta annotazione di alcuni metaboliti con i metodi attualmente utilizzati. In quarto luogo, i database online spettrali di massa esistenti di ioni genitori (MS1) e ioni secondari (MS2) sono incompleti; ciò influisce sulla corretta identificazione e quantificazione di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS prodotti con l’aiuto dei metodi attuali. In quinto luogo, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua. Sesto, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di colonna LC per separare l’uno dall’altro tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua.

Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni per la tempra dell’attività metabolica all’interno delle cellule di S. cerevisiae, mantenendo la maggior parte dei metaboliti idrosolubili all’interno di queste cellule prima dell’estrazione ed estraendo la maggior parte delle classi di metaboliti idrosolubili dalle cellule di lievito. Abbiamo sviluppato un metodo versatile, robusto e sensibile per l’identificazione e la quantificazione basata su LC-MS/MS di oltre 370 metaboliti idrosolubili estratti dalle cellule di S. cerevisiae. Questo metodo di metabolomica non mirata consente di valutare le concentrazioni intracellulari di varie molecole vettore energetico, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS sviluppato consente l’identificazione e la quantificazione di diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche.

Protocol

1. Fare e sterilizzare un mezzo per la coltivazione del lievito Fare 180 ml di un estratto di lievito completo con bactopeptone (YP) mezzo. Il mezzo YP completo contiene l’1% (p/v) di estratto di lievito e il 2% (p/v) di bactopeptone. Distribuire 180 mL del mezzo YP in modo equo in quattro palloni Erlenmeyer da 250 mL. Ognuno di questi palloni contiene 45 ml del mezzo YP. Sterilizzare i palloni con YP medium mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min. 2. C…

Representative Results

Per migliorare una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all’interno di una cellula di lievito, abbiamo ottimizzato le condizioni di tempra cellulare per il rilevamento dei metaboliti. La tempra cellulare per questo scopo comporta un rapido arresto di tutte le reazioni enzimatiche all’interno di una cellula31,33,37,38. Tale arresto dell’attiv…

Discussion

Per utilizzare con successo il protocollo qui descritto, seguire le misure preventive descritte di seguito. Il cloroformio e il metanolo estraggono varie sostanze dalla plastica da laboratorio. Pertanto, maneggiarli con cautela. Evitare l’uso di materie plastiche in fasi che comportano il contatto con uno di questi due solventi organici. Utilizzare pipette in vetro borosilicato per questi passaggi. Sollevare queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell’uso. Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in poliprop…

Materials

Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049