Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией
Summary
Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.
Abstract
Метаболомика – это методология, используемая для идентификации и количественной оценки многих низкомолекулярных промежуточных продуктов и продуктов метаболизма в клетке, ткани, органе, биологической жидкости или организме. Метаболомика традиционно фокусируется на водорастворимых метаболитах. Водорастворимый метаболом является конечным продуктом сложной клеточной сети, которая объединяет различные геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные и экологические факторы. Следовательно, метаболомический анализ непосредственно оценивает результат действия для всех этих факторов во множестве биологических процессов в различных организмах. Одним из таких организмов является почкование дрожжей Saccharomyces cerevisiae,одноклеточный эукариот с полностью секвенированным геномом. Поскольку S. cerevisiae поддастся всестороннему молекулярному анализу, он используется в качестве модели для препарирования механизмов, лежащих в основе многих биологических процессов в эукариотической клетке. Универсальный аналитический метод для надежной, чувствительной и точной количественной оценки водорастворимого метаболома обеспечит необходимую методологию для анализа этих механизмов. Здесь представлен протокол оптимизации условий гашения метаболической активности и извлечения водорастворимых метаболитов из клеток S. cerevisiae. Протокол также описывает использование жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа экстрагированных водорастворимых метаболитов. Описанный здесь метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами, включая различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. Метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Метод успешно используется для оценки водорастворимых метаболомов диких и мутантных дрожжевых клеток, культивированных в различных условиях.
Introduction
Водорастворимые метаболиты представляют собой низкомолекулярные промежуточные продукты и продукты метаболизма, которые способствуют необходимым клеточным процессам. Эти эволюционно сохраненные процессы включают преобразование питательных веществ в пригодную для использования энергию, синтез макромолекул, клеточный рост и передачу сигналов, контроль клеточного цикла, регуляцию экспрессии генов, реакцию на стресс, посттрансляционную регуляцию метаболизма, поддержание функциональности митохондрий, везикулярный клеточный транспорт, аутофагию, клеточное старение и регулируемую гибель клеток1,2,3.
Многие из этих важных ролей водорастворимых метаболитов были обнаружены исследованиями в почковых дрожжах S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Этот одноклеточный эукариот является полезным модельным организмом для рассечения механизмов, с помощью которых водорастворимые метаболиты способствуют клеточным процессам благодаря своей податливости передовым биохимическим, генетическим и молекулярно-биологическим анализам23,24,25,26. Хотя методы нецелевой метаболомики LC-MS/MS были использованы для изучения роли водорастворимых метаболитов в почковых дрожжах3,18,22,27,этот тип анализа требует улучшения его универсальности, надежности, чувствительности и способности различать различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов.
Последние годы отмечены значительными успехами в применении методов нецелевой метаболомики LC-MS/MS для профилирования водорастворимых метаболитов in vivo. Тем не менее, многие проблемы в использовании этой методологииостаются2,28, 29,30, 31,32,33,34,35,36. Эти проблемы включают в себя следующее. Во-первых, внутриклеточные концентрации многих водорастворимых метаболитов ниже порога чувствительности для применяемых в настоящее время методов. Во-вторых, эффективность гашения метаболической активности слишком низка, а степень связанной с гашением клеточной утечки внутриклеточных метаболитов слишком высока для современных методов; следовательно, используемые в настоящее время методы недооценивают внутриклеточные концентрации водорастворимых метаболитов. В-третьих, существующие методы не могут дифференцировать структурные изомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой, но разной атомной связностью) или стереоизомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой и атомной связностью, но с разным расположением атомов в пространстве) конкретных метаболитов; это препятствует правильной аннотации некоторых метаболитов используемыми в настоящее время методами. В-четвертых, существующие масс-спектральные онлайн-базы данных родительских ионов (MS1) и вторичных ионов (MS2) являются неполными; это влияет на правильную идентификацию и количественное определение конкретных метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS/MS, полученных с помощью современных методов. В-пятых, существующие методы не могут использовать один тип экстракции метаболитов для восстановления всех или большинства классов водорастворимых метаболитов. В-шестых, существующие методы не могут использовать один тип колонки LC для отделения друг от друга всех или большинства классов водорастворимых метаболитов.
Здесь мы оптимизировали условия для гашения метаболической активности в клетках S. cerevisiae, поддержания большинства водорастворимых метаболитов в этих клетках перед экстракцией и извлечения большинства классов водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток. Мы разработали универсальный, надежный и чувствительный метод идентификации и количественной оценки более 370 водорастворимых метаболитов, извлеченных из клеток S. cerevisiae на основе LC-MS/MS. Этот метод нецелевой метаболомики позволяет оценить внутриклеточные концентрации различных молекул-энергоносителей, нуклеотидов, аминокислот, моносахаридов, промежуточных продуктов гликолиза и промежуточных продуктов трикарбоксового цикла. Разработанный метод LC-MS/MS позволяет идентифицировать и количественно оценить различные структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы успешно использовать описанный здесь протокол, следуйте профилактическим мерам, описанным ниже. Хлороформ и метанол извлекают различные вещества из лабораторной пластичной посуды. Поэтому относитесь к ним с осторожностью. Избегайте использования пластмасс на этапах, которые в?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы выражаем признательность Центру биологических применений масс-спектрометрии, Центру структурной и функциональной геномики и Центру микроскопии и клеточной визуализации (все в Университете Конкордия) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482 и CRDPJ 515900 – 17). K.M. был поддержан стипендией Арманда К. Аршамбо Университета Конкордия и премией декана университета Конкордия за выдающиеся достижения.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
Riferimenti
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetica. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetica. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetica. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
