In-Nucleus Hi-C i Drosophila celler
Summary
Genomet är organiserat i kärnrummet i olika strukturer som kan avslöjas genom kromosomkonformationsfångstteknik. Hi-C-metoden i nukleus ger en genomomfattande samling kromatininteraktioner i Drosophila-cellinjer, som genererar kontaktkartor som kan utforskas vid megabasupplösning på begränsningsfragmentnivå.
Abstract
Genomet är organiserat i topologiskt associerande domäner (TADs) avgränsade av gränser som isolerar interaktioner mellan domäner. I Drosophila är de mekanismer som ligger till grund för TAD-bildandet och gränserna fortfarande under utredning. Tillämpningen av in-nucleus Hi-C-metoden som beskrivs här hjälpte till att dissekera funktionen av arkitektoniskt protein (AP)-bindande platser vid TAD-gränser som isolerar skårgenen. Genetisk modifiering av domängränser som orsakar förlust av APs resulterar i TAD fusion, transkriptionella defekter och långdistans topologiska förändringar. Dessa resultat gav bevis som visar bidrag av genetiska element till domän gränsbildning och genuttryck kontroll i Drosophila. Här har hi-C-metoden i nukleus beskrivits i detalj, vilket ger viktiga kontrollpunkter för att bedöma experimentets kvalitet tillsammans med protokollet. Också visas de erforderliga numrerar av sekvenseringläsningar och giltiga Hi-C parar för att analysera genomic växelverkan på olika genomic fjäll. CRISPR/Cas9-medierad genetisk redigering av regulatoriska element och högupplöst profilering av genomiska interaktioner med hjälp av detta in-nucleus Hi-C-protokoll kan vara en kraftfull kombination för undersökning av genetiska elements strukturella funktion.
Introduction
I eukaryoter delas genomet i kromosomer som upptar specifika territorier i kärnområdet under interfas1. Kromatin som bildar kromosomerna kan delas in i två huvudstater: en av tillgängliga kromatin som är transkriptionellt tillåtande, och den andra av kompakt kromatin som är transkriptionellt repressiv. Dessa kromatin tillstånd segregera och blanda sällan i kärnrummet, bildar två distinkta fack i kärnan2. På sub-megabase-skalan separerar gränser domäner för högfrekventa kromatininteraktioner, så kallade TADs, som markerar kromosomorganisation3,4,5. Hos däggdjur upptas TAD-gränserna av kohins och CCCTC-bindande faktor (CTCF)6,7,8. Det sammanhållna komplexet extruderar kromatin och stannar vid CTCF-bindande platser som kasseras i konvergent orientering i den genomiska sekvensen för att bilda stabila kromatinöglor9,10,13,14. Genetisk störning av CTCF DNA-bindande plats vid gränserna eller minskning av CTCF och kohin protein överflöd resulterar i onormala interaktioner mellan reglerande element, förlust av TAD bildas och genuttryck avreglering9,10,11,13,14.
I Drosophila, Gränserna mellan TADs upptas av flera APs, inklusive gränselement-associerade faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindande protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), suppressor av hårig vinge (SuHW) och CTCF, och berikas i aktiva histon modifieringar och Polymerase II16,17,18. Det har föreslagits att i Drosophila visas TADs som en följd av transkription13,17,19, och den exakta rollen av oberoende APs i gränsbildning och isoleringsegenskaper är fortfarande under utredning. Huruvida domäner i Drosophila är en enda följd av aggregering av regioner med liknande transkriptionstillstånd eller om APs, inklusive CTCF, bidrar till gränsbildning återstår därför att helt karakterisera. Utforskning av genomiska kontakter med hög upplösning har varit möjlig genom utveckling av kromosomkonformationsfångstteknik i kombination med nästa generations sekvensering. Hi-C protokollet beskrevs först med ligatur steget utförs “i lösning”2 i ett försök att undvika falska ligatur produkter mellan kromatin fragment. Flera studier pekade dock på insikten att den användbara signalen i data kom från ligaturprodukter som bildats vid delvis lysade atomkärnor som inte fanns i lösning20,21.
Protokollet ändrades sedan för att utföra ligaturen inuti kärnan som en del av Hi-C-experimentet med en cell22. Hi-C-protokollet i nukleos införlivades därefter i cellpopulationen Hi-C för att ge en mer konsekvent täckning över hela skalet av genomiska avstånd och producera data med mindre tekniskt brus23,24. Protokollet, som beskrivs i detalj här, är baserat på populationen i kärnan Hi-C protokoll23,24 ochanvändes för att undersöka konsekvenserna av genetiskt avlägsnande DNA-bindande motiv för CTCF och M1BP från en domängräns vid Notch gen locus i Drosophila25. Resultaten visar att en ändring av DNA-bindande motiv för APs vid gränsen har drastiska konsekvenser för Notch domänbildning, större topologiska defekter i regionerna kring Notch locus och genuttryck avreglering. Detta indikerar att genetiska element vid domängränser är viktiga för upprätthållandet av genomtopologi och genuttryck i Drosophila25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hi-C-metoden i nukleos som presenteras här har möjliggjord detaljerad utforskning av Drosophila genomtopologi med hög upplösning, vilket ger en bild av genomiska interaktioner i olika genomiska skalor, från kromatinöglor mellan regulatoriska element som promotors och förstärkare till TADs och stor fackidentifiering25. Samma teknik har också tillämpats effektivt på däggdjursvävnader med vissa modifieringar33. Till exempel, vid bearbetning av en vävnad istället…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) bidragsnummer 207319 och Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) anslagsnummer 303068. A.E.-L. är en masterstudent med stöd av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU-nummer 968128.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
Riferimenti
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
