In-Nucleus Hi-C в клетках дрозофилы
Summary
Геном организован в ядерном пространстве в различные структуры, которые могут быть выявлены с помощью технологий захвата конформации хромосом. Метод Hi-C в ядре обеспечивает общегеномную коллекцию взаимодействий хроматинов в клеточных линиях дрозофилы, которая генерирует контактные карты, которые могут быть исследованы с разрешением мегабазы на уровне рестстриктного фрагмента.
Abstract
Геном организован в топологически ассоциирующие домены (TAD), разграниченные границами, которые изолируют взаимодействия между доменами. У дрозофилы механизмы, лежащие в основе формирования и границ TAD, все еще исследуются. Применение описанного здесь метода Hi-C в ядре помогло препарировать функцию архитектурных белковых (AP)-связывающих сайтов на границах TAD, изолируя ген Notch. Генетическая модификация границ доменов, которая вызывает потерю ТОП, приводит к слиянию TAD, транскрипционным дефектам и дальнодейственным топологическим изменениям. Эти результаты предоставили доказательства, демонстрирующие вклад генетических элементов в формирование границ домена и контроль экспрессии генов у дрозофилы. Здесь подробно описан метод Hi-C в ядре, который обеспечивает важные контрольные точки для оценки качества эксперимента вместе с протоколом. Также показано необходимое количество показанных показаний секвенирования и действительных пар Hi-C для анализа геномных взаимодействий в различных геномных масштабах. CRISPR/Cas9-опосредованное генетическое редактирование регуляторных элементов и профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием этого протокола Hi-C в ядре может стать мощной комбинацией для исследования структурной функции генетических элементов.
Introduction
У эукариот геном разделен на хромосомы, которые занимают определенные территории в ядерном пространстве во время интерфазы1. Хроматин, образующий хромосомы, можно разделить на два основных состояния: одно из доступных хроматинов, которые являются транскрипционно разрешительными, и другое из компактного хроматина, который является транскрипционно репрессивным. Эти хроматиновые состояния отделяются и редко смешиваются в ядерном пространстве, образуя два отдельных отсека в ядре2. В масштабе субмегабазы границы разделяют области высокочастотных хроматиновых взаимодействий, называемые TADs, которые отмечают хромосомную организацию3,4,5. У млекопитающих границы TAD занимают когезионные и CCCTC-связывающий фактор (CTCF)6,7,8. Когезионный комплекс выдавливает хроматин и останавливается на CTCF-сайтах связывания, которые расположены в конвергентной ориентации в геномной последовательности с образованием стабильных хроматиновых петель9,10,13,14. Генетическое нарушение сайта связывания ДНК CTCF на границах или снижение CTCF и изобилия белка когезгена приводит к аномальным взаимодействиям между регуляторными элементами, потере образования TAD и дерегуляции экспрессии генов9,10,11,13,14.
У дрозофилы границы между TAD заняты несколькими ПП, включая граничный элемент-ассоциированный фактор 32 кДа (BEAF-32), связывающий белок Motif 1 (M1BP), центросомальный белок 190 (CP190), супрессор волосатого крыла (SuHW) и CTCF, и обогащены активными модификациями гистонов и полимеразой II16,17,18. Было высказано предположение, что у дрозофилы TAD появляются как следствие транскрипции13,17,19,и точная роль независимых ТОс в формировании границ и изоляционных свойствах все еще находится в стадии изучения. Таким образом, вопрос о том, являются ли домены у дрозофилы единственным следствием агрегации областей сходных транскрипционных состояний или же АП, включая CTCF, способствуют формированию границ, еще предстоит полностью охарактеризовать. Исследование геномных контактов с высоким разрешением стало возможным благодаря разработке технологий захвата конформации хромосом в сочетании с секвенированием следующего поколения. Протокол Hi-C был впервые описан с этапом лигирования, выполненным «в растворе»2 в попытке избежать ложных продуктов лигирования между фрагментами хроматина. Однако несколько исследований указали на осознание того, что полезный сигнал в данных исходил от продуктов лигирования, образуемых в частично лизированных ядрах, которые не находились в растворе20,21.
Затем протокол модифицировали для выполнения лигирования внутри ядра в рамках одноклеточного эксперимента Hi-C22. Протокол Hi-C в ядре был впоследствии включен в клеточную популяцию Hi-C, чтобы обеспечить более последовательное покрытие во всем диапазоне геномных расстояний и получить данные с меньшим техническим шумом23,24. Протокол, подробно описанный здесь, основан на популяционно-ядровом протоколеHi-C 23,24 и использовался для исследования последствий генетического удаления ДНК-связывающих мотивов для CTCF и M1BP с границы домена в локусе гена Notch в Drosophila25. Результаты показывают, что изменение ДНК-связывающих мотивов для ТОП на границе имеет радикальные последствия для формирования домена Notch, более крупных топологических дефектов в областях, окружающих локус Notch, и дерегуляции экспрессии генов. Это указывает на то, что генетические элементы на границах домена важны для поддержания топологии генома и экспрессии генов у Drosophila25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь метод Hi-C в ядре позволил детально исследовать топологию генома дрозофилы с высоким разрешением, обеспечивая представление о геномных взаимодействиях в различных геномных масштабах, от хроматиновых петель между регуляторными элементами, такими как промоторы и э?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Программы технологических инноваций и поддержки исследований UNAM (PAPIIT) IN207319 и грантом Национального совета по науке и технике (CONACyT-FORDECyT) номер 303068. А.Е.-Л. является студентом магистратуры при поддержке Национального совета по науке и технике (CONACyT) CVU No 968128.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
Riferimenti
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
