In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen
Summary
Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.
Abstract
Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.
Introduction
Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase1bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern2. Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomenorganisation3,4,5markieren. Bei Säugetieren werden TAD-Grenzen durch Cohesin und CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)6,7,8besetzt. Der Cohesin-Komplex extrudiert Chromatin und stoppt an CTCF-Bindungsstellen, die in konvergenter Orientierung in der genomischen Sequenz angeordnet sind, um stabile Chromatinschleifen9,10,13,14zu bilden. Genetische Störung der CTCF-DNA-Bindungsstelle an den Grenzen oder Verringerung der CTCF- und Cohesinproteinhäufigkeit führt zu abnormalen Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen, Verlust der TAD-Bildung und Deregulierung der Genexpression9,10,11,13,14.
Bei Drosophila werden die Grenzen zwischen TADs von mehreren APs besetzt, darunter der Grenzelement-assoziierte Faktor 32 kDa (BEAF-32), das Motif 1-Bindungsprotein (M1BP), das zentromale Protein 190 (CP190), der Suppressor des Haarflügels (SuHW) und CTCF, und sind mit aktiven Histonmodifikationen und Polymerase II16,17,18angereichert. Es wurde vermutet, dass bei Drosophila TADs als Folge der Transkription13 , 17,19auftreten, und die genaue Rolle unabhängiger APs bei der Grenzbildung und den Isolationseigenschaften wird noch untersucht. Ob Domänen in Drosophila eine alleinige Folge der Aggregation von Regionen ähnlicher Transkriptionszustände sind oder ob APs, einschließlich CTCF, zur Grenzbildung beitragen, muss daher noch vollständig charakterisiert werden. Die Erforschung genomischer Kontakte mit hoher Auflösung wurde durch die Entwicklung von Chromosomenkonformationserfassungstechnologien in Verbindung mit sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht. Das Hi-C-Protokoll wurde erstmals mit dem Ligationsschritt “in Lösung”2 beschrieben, um falsche Ligationsprodukte zwischen Chromatinfragmenten zu vermeiden. Mehrere Studien wiesen jedoch auf die Erkenntnis hin, dass das nützliche Signal in den Daten von Ligationsprodukten stammte, die an teilweise lysierten Kernen gebildet wurden, die nicht in Lösung20,21waren .
Das Protokoll wurde dann modifiziert, um die Ligatur im Kern als Teil des Einzelzell-Hi-C-Experiments22durchzuführen. Das In-Nucleus-Hi-C-Protokoll wurde anschließend in die Zellpopulation Hi-C integriert, um eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen zu erzielen und Daten mit weniger technischem Rauschen zu erzeugen23,24. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll basiert auf dem Population in-nucleus Hi-C Protokoll23,24 und wurde verwendet, um die Folgen der genetischen Entfernung von DNA-bindenden Motiven für CTCF und M1BP von einer Domänengrenze am Notch-Genlocus in Drosophila25zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung der DNA-bindungsnden Motive für APs an der Grenze drastische Folgen für die Bildung der Notch-Domäne, größere topologische Defekte in den Regionen rund um den Notch-Locus und die Deregulierung der Genexpression hat. Dies deutet darauf hin, dass genetische Elemente an Domänengrenzen für die Aufrechterhaltung der Genomtopologie und Genexpression in Drosophila25wichtig sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente25. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die ZUSCHUSSNUMMER IN207319 des UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) und die Fördernummer 303068 des Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) unterstützt. == ist ein Masterstudent, der vom Science and Technology National Council (CONACyT) CVU Nummer 968128 unterstützt wird.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
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