Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

Summary

Questo protocollo di frazionamento consentirà ai ricercatori di isolare proteine citoplasmatiche, nucleari, mitocondriali e di membrana da cellule di mammifero. Le ultime due frazioni subcellulari vengono ulteriormente purificate tramite gradiente di densità isopicnica.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere frazioni proteiche subcellulari da cellule di mammifero utilizzando una combinazione di detergenti, lisi meccanica e centrifugazione a gradiente di densità isopicnica. Il vantaggio principale di questa procedura è che non si basa sul solo uso di detergenti solubilizzanti per ottenere frazioni subcellulari. Ciò consente di separare la membrana plasmatica da altri organelli legati alla membrana della cellula. Questa procedura faciliterà la determinazione della localizzazione delle proteine nelle cellule con un metodo riproducibile, scalabile e selettivo. Questo metodo è stato utilizzato con successo per isolare proteine citosoliche, nucleari, mitocondriali e di membrana plasmatica dalla linea cellulare monocitaria umana, U937. Sebbene ottimizzata per questa linea cellulare, questa procedura può servire come punto di partenza adatto per il frazionamento subcellulare di altre linee cellulari. Le potenziali insidie della procedura e come evitarle sono discusse così come le alterazioni che potrebbero dover essere considerate per altre linee cellulari.

Introduction

Il frazionamento subcellulare è una procedura in cui le cellule vengono lisate e separate nei loro componenti costitutivi attraverso diversi metodi. Questa tecnica può essere utilizzata dai ricercatori per determinare la localizzazione delle proteine nelle cellule di mammifero o per l’arricchimento di proteine a bassa abbondanza che altrimenti non sarebbero rilevabili. Mentre attualmente esistono metodi per il frazionamento subcellulare, così come i kit commerciali che possono essere acquistati, soffrono di diverse limitazioni che questa procedura tenta di superare. La maggior parte dei metodi di frazionamento cellulare sono esclusivamente a base di detergente^1,2, basandosi sull’uso di tamponi contenenti quantità crescenti di detergente per solubilizzare diversi componenti cellulari. Mentre questo metodo è rapido e conveniente, si traduce in frazioni impure. Questi sono progettati per consentire ai ricercatori di isolare facilmente uno o due componenti della cellula, ma non sono abbastanza complessi da isolare più frazioni subcellulari da un campione allo stesso tempo. Affidarsi esclusivamente ai detergenti di solito si traduce in organelli chiusi in membrana e la membrana plasmatica solubilizzata indiscriminatamente, rendendo difficile la separazione di questi componenti. Un’ulteriore complicazione derivante dall’uso di questi kit è l’incapacità dei ricercatori di modificarli / ottimizzarli per applicazioni specifiche, poiché la maggior parte dei componenti sono formulazioni proprietarie. Infine, questi kit possono essere proibitivamente costosi, con limitazioni nel numero di usi che li rendono meno ideali per campioni più grandi.

Nonostante la disponibilità di kit per l’isolamento dei mitocondri che non si basano su detergenti, non sono progettati per isolare la membrana plasmatica e produrre quantità significativamente inferiori di campione rispetto ai protocolli di isolamento standard ^3,4. Mentre i metodi di centrifugazione differenziale richiedono più tempo, spesso si traducono in frazioni distinte che non possono essere ottenute con kit esclusivamente a base di detergenti¹. La separazione senza il solo uso di detergenti solubilizzanti consente anche un’ulteriore purificazione utilizzando ultracentrifugazione e gradienti di densità isopicnica, con conseguente minore contaminazione incrociata. Questo protocollo di frazionamento dimostra l’isolamento delle frazioni subcellulari dai monociti U937 utilizzando una combinazione di approcci basati su detergenti e centrifugazione ad alta velocità. Questo metodo faciliterà l’isolamento dei componenti nucleari, citoplasmatici, mitocondriali e della membrana plasmatica di una cellula di mammifero con una contaminazione minima tra le frazioni.

Protocol

1. Preparare tamponi e reagenti Preparare soluzioni fresche di fosfatasi e inibitori della proteasi.Aggiungere 17,4 mg di fenilmetansulfonil fluoruro (PMSF) a 1 mL di etanolo al 100% per preparare una scorta di 100 mM.NOTA: Indossare dispositivi di protezione quando si maneggia PMSF in quanto è pericoloso se ingerito o inalato e a contatto con la pelle o gli occhi. È corrosivo per gli occhi e la pelle. Secondo le istruzioni del produttore, preparare un cocktail inibitore della proteasi …

Representative Results

Un diagramma di flusso schematico di questa procedura (Figura 1) riassume visivamente i passi che sono stati intrapresi per frazionare con successo U9375 cellule cresciute in sospensione. Le frazioni raccolte dalla parte superiore del gradiente di densità isopicnica in volumi uguali (1 ml) mostrano la purificazione delle frazioni mitocondriali e di membrana (Figura 2). L’utilizzo di un anticorpo contro VDAC, una proteina localizzata nell…

Discussion

Questo metodo è una versione modificata di un approccio precedentemente pubblicato al frazionamento subcellulare senza l’uso della centrifugazione ad alta velocit๹. Questo metodo modificato richiede attrezzature più specializzate per ottenere i migliori risultati, ma è più completo e costantemente riproducibile.

Lo sviluppo del protocollo iniziale è stato necessario a causa dell’incapacità di separare campioni mitocondriali e di membrana per l’analisi della loc…

Materials

Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661