U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu
Summary
Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.
Abstract
Bu protokol, deterjanlar, mekanik lizis ve izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kombinasyonunu kullanarak memeli hücrelerinden hücre altı protein fraksiyonları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu prosedürün en büyük avantajı, hücre altı fraksiyonları elde etmek için çözünürleştirici deterjanların tek kullanımına dayanmamasıdır. Bu, plazma zarını hücrenin diğer zara bağlı organellerinden ayırmayı mümkün kılar. Bu prosedür, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve seçici bir yöntemle hücrelerde protein lokalizasyonunun belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve plazma membran proteinlerini insan monosit hücre hattı U937’den izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu hücre hattı için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu prosedür diğer hücre hatlarının hücre altı fraksiyonasyonu için uygun bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Prosedürün potansiyel tuzakları ve bunlardan nasıl kaçınılacağı, diğer hücre hatları için dikkate alınması gereken değişiklikler gibi tartışılmaktadır.
Introduction
Subselüler fraksiyonasyon, hücrelerin lize edildiği ve çeşitli yöntemlerle kurucu bileşenlerine ayrıldığı bir prosedürdür. Bu teknik, araştırmacılar tarafından memeli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek veya aksi takdirde tespit edilemeyecek düşük bolluktaki proteinlerin zenginleştirilmesi için kullanılabilir. Hücre altı fraksiyonasyon yöntemleri şu anda mevcut olsa da, satın alınabilecek ticari kitler gibi, bu prosedürün üstesinden gelmeye çalıştığı çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler. Çoğu hücre fraksiyonasyon yöntemi, farklı hücresel bileşenleri çözündürmek için artan miktarda deterjan içeren tamponların kullanımına dayanan sadece deterjan bazlı 1,2’dir. Bu yöntem hızlı ve kullanışlı olsa da, saf olmayan fraksiyonlarla sonuçlanır. Bunlar, araştırmacıların hücrenin bir veya iki bileşenini kolayca izole etmelerini sağlamak için tasarlanmıştır, ancak aynı anda bir numuneden birden fazla hücre altı fraksiyonu izole edecek kadar karmaşık değildir. Yalnızca deterjanlara güvenmek genellikle membranla kaplı organellere ve plazma zarının ayrım gözetmeksizin çözünmesine neden olur ve bu bileşenlerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu kitlerin kullanımından kaynaklanan ek bir komplikasyon, bileşenlerin çoğu tescilli formülasyonlar olduğundan, araştırmacıların belirli uygulamalar için bunları değiştirememesi / optimize edememesidir. Son olarak, bu kitler, daha büyük numuneler için ideal olandan daha az olmasını sağlayan kullanım sayısındaki sınırlamalarla yasaklayıcı bir şekilde pahalı olabilir.
Deterjanlara dayanmayan mitokondrilerin izolasyonu için kitlerin mevcudiyetine rağmen, plazma zarını izole etmek ve standart izolasyon protokollerinden önemli ölçüde daha düşük miktarda numune vermek için tasarlanmamışlardır 3,4. Diferansiyel santrifüjleme yöntemleri daha fazla zaman alıcı olsa da, genellikle sadece deterjan bazlı kitlerle elde edilemeyen farklı fraksiyonlarla sonuçlanırlar1. Çözünürleştirici deterjanların tek başına kullanılmadan ayrılması, ultrasantrifüjleme ve izopiknik yoğunluk gradyanları kullanılarak daha fazla saflaştırmaya izin vererek daha az çapraz kontaminasyona neden olur. Bu fraksiyonasyon protokolü, deterjan ve yüksek hızlı santrifüjleme tabanlı yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak U937 monositlerinden hücre altı fraksiyonların izolasyonunu göstermektedir. Bu yöntem, bir memeli hücresinin nükleer, sitoplazmik, mitokondriyal ve plazma zarı bileşenlerinin, fraksiyonlar arasında minimum kirlenme ile izolasyonunu kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, yüksek hızlı santrifüjleme11 kullanılmadan hücre altı fraksiyonasyona yönelik daha önce yayınlanmış bir yaklaşımın değiştirilmiş bir versiyonudur. Bu modifiye yöntem, en iyi sonuçları elde etmek için daha özel ekipman gerektirir, ancak daha kapsamlı ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.
İlk protokolün geliştirilmesi, nekroptoz12 sırasında protein lokalizasyonunun analizi için mitokondriyal ve membran …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R15-HL135675-01 ve NIH 2 R15-HL135675-02 tarafından T.J.L.’ye desteklenmiştir.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Riferimenti
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
