Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Summary

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Abstract

Neurotransmissores de monoamina estão associados a inúmeras doenças neurológicas e psiquiátricas. Modelos animais de tais condições têm mostrado alterações na liberação e dinâmica de absorção de neurotransmissores de monoamina. Métodos tecnicamente complexos como eletrofisiologia, Voltammetry Ciclílica de Varredura Rápida (FSCV), imagem, microdiálise in vivo, optogenética ou uso de radioatividade são necessários para estudar a função monoamina. O método aqui apresentado é uma abordagem otimizada em duas etapas para detectar a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas usando uma placa de 48 poços contendo suportes teciduais para examinar a liberação de monoamina, e cromatografia líquida de alto desempenho, juntamente com a detecção eletroquímica (HPLC-ECD) para medição de liberação de monoamina. Resumidamente, seções cerebrais de ratos contendo regiões de interesse, incluindo córtex pré-frontal, hipocampo e estriado dorsal foram obtidas usando um cortador de tecido ou vibratome. Essas regiões de interesse foram dissecadas de todo o cérebro e incubadas em um tampão fisiológico oxigenado. A viabilidade foi examinada ao longo do curso de tempo experimental, por 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT). As regiões cerebrais dissecadas agudamente foram incubadas em diferentes condições de drogas que são conhecidas por induzir a liberação de monoamina através do transportador (anfetamina) ou através da ativação da liberação vesicular exociótica (KCl). Após a incubação, os produtos liberados no supernasciente foram coletados e analisados por meio de um sistema HPLC-ECD. Aqui, a liberação de monoamina basal é detectada pelo HPLC a partir de fatias cerebrais agudas. Esses dados suportam resultados in vivo e in vitro anteriores mostrando que a versão de amph e kcl induzem a liberação de monoamina. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos associados à liberação dependente de transporte de monoamina e oferece uma oportunidade de triagem de compostos que afetam a liberação de monoamina de forma rápida e de baixo custo.

Introduction

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, ^{depressão1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedade2, ^vício4, ^{menopausa5,6,7}, ^dor8 e doença de ^Parkinson3. Por exemplo, vários modelos de ratos da menopausa mostraram que a desregulação ou redução de monoaminas dentro do hipocampo, córtex pré-frontal e estriato podem estar associados tanto à depressão quanto ao declínio cognitivo, que é visto em mulheres que experimentam a menopausa. A desregulação das monoaminas nesses modelos tem sido extensivamente examinada por meio do HPLC-ECD, embora os estudos não discriminaram o conteúdo medido do neurotransmissor versus a liberação de neurotransmissores5,6,7. As monoaminas são liberadas clássicamente no espaço extracelular através da liberação vesicular dependente de ^Ca2+, ^e são recicladas de volta através de seu respectivo sistema de recaptação de membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)^10,11. Por outro lado, os dados sugerem que esses transportadores são capazes de liberar ou monoaminas efflux, uma vez que drogas de abuso como anfetamina (ANFE) e 3,4-Methylenedioximethamfetamina (MDMA) são conhecidas por liberar DA e 5-HT, respectivamente através de seus sistemas de ^{transporte12,13,} 14,15,16,17 . Assim, uma compreensão mecanicista adequada da dinâmica de liberação de monoaminas é crucial para o desenvolvimento de farmacoterapeias específicas e direcionadas.

Uma ampla gama de técnicas foram empregadas para estudar a liberação de monoaminas como a Voltammetry Ciálica de Varredura Rápida (FSCV)¹⁸, in vivo microdiálise13, ^imagem19, pré-inincubtação com monoaminas radiolabeled20, optogenética e, mais recentemente, sensores fluorescentes geneticamente codificados e ^{fotometria21,22} . A microdiálise FSCV e in vivo são as principais técnicas utilizadas para o estudo da liberação de monoaminas. O FSCV é usado para estudar a liberação exocitomática estimulada de, principalmente, DA em fatias cerebrais agudas e in ^vivo23. Como o FSCV usa eletrodos para estimular ou evocar a liberação, a principal fonte de liberação de neurotransmissores é a liberação vesicular dependente de Ca218,24,25,26,27,28,29,30,31 . A microdiálise in vivo juntamente com o HPLC mede mudanças nos níveis de neurotransmissor extracelular usando uma sonda colocada em uma área cerebral de ^{interesse13,32}. Semelhante ao FSCV, uma grande limitação à microdiálise in vivo é a dificuldade em determinar a fonte de liberação de neurotransmissores: liberação vesicular dependente de ^Ca2+ ou dependente de transporte. Vale ressaltar que ambos os métodos permitem a medição direta da liberação de monoamina. Através do recente avanço da optogenética, pesquisas demonstram a detecção da liberação de 5-HT e DA em um curto espaço de tempo com especificidade requintada do tipo ^celular21,22. No entanto, essas estratégias requerem técnicas e equipamentos complexos e caros, e medem indiretamente a liberação de monoamina, especificamente através da monoamina que liga aos receptores. Além disso, as monoaminas radiolabeladas também são usadas para estudar a dinâmica da monoamina. As monoaminas radiolabeladas podem ser pré-carregadas em vários sistemas de modelo, como células heterólogas que superexpressam cada transporte monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neurônios ^primários20, sinapstos33,39,41^{, 42}, e cortes cerebrais ^agudas43,44. No entanto, a radioatividade representa danos potenciais ao experimentador, e os analitos rotulados com trítio podem não recapitular fielmente a dinâmica endógena da ^{monoamina45,46}. Sistemas de superfusão combinados com métodos de detecção off-line, como o HPLC-ECD, permitiram a detecção de monoaminas de múltiplas fontes de tecido. Aqui, este protocolo fornece como um método otimizado e de baixo custo, simples e preciso usando fatias cerebrais agudas para medir diretamente a liberação de basal endógeno e estimulada.

As fatias cerebrais agudas permitem testar hipóteses mecanicistas, principalmente porque preservam o microambiente anatômico in vivo, e mantêm sinapses intactas47,48,49,50,51,52. Em alguns estudos, fatias cerebrais agudas ou tecido cerebral picado têm sido usados em conjunto com uma técnica de superfusão usando KCl para estimular a liberação mediada ^ca2+53,54,55,56. Os sistemas de superfusão têm sido fundamentais para avançar a compreensão do campo sobre os mecanismos de liberação de neurotransmissores, incluindo as monoaminas. No entanto, esses sistemas são relativamente caros, e o número de câmaras disponíveis para análise de tecidos varia de 4 a 12. Em comparação, o método aqui apresentado é barato, permite a medição de 48 amostras de tecido, podendo ser refinado para usar até 96 amostras de tecido. Cada poço dentro da placa de 48 poços contém suportes de tecido que usam filtros para separar o produto liberado do tecido, e as monoaminas liberadas são então coletadas e analisadas pelo HPLC-ECD. É importante ressaltar que este método permite a medição simultânea de 5-HT, DA e NE de diferentes áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal, o hipocampo e o estriado dorsal após o tratamento com agentes farmacológicos que modulam a liberação de monoamina. Assim, o experimentador pode responder a várias perguntas usando um sistema multi-poço barato que aumenta o número de amostras testadas e, assim, reduzindo o número de animais utilizados.

Protocol

Todos os experimentos, incluindo manejo de animais e coleta de tecidos, foram realizados de acordo com a Universidade da Flórida e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), seguindo o protocolo aprovado 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Para reagentes e tampão, consulte o Arquivo Suplementar. 1. Prepare fatias agudas do cérebro de ratos NOTA: Neste experimento foram utilizados ratos machos adultos (250-350 g). No entanto, essa confi…

Representative Results

Esta técnica descreve o uso de fatias cerebrais para medir a liberação de monoaminas endógenas usando HPLC com detecção eletroquímica baseada em uma placa de 48 poços com um suporte interno de tecido. A configuração experimental é retratada na Figura 1 e Figura 2. Inicialmente, para garantir a viabilidade tecidual até o final da experimentação, foi realizado um ensaio de MTT (4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenilt…

Discussion

As medidas de liberação de monoaminas têm sido realizadas durante anos em vários sistemas como células heterólogas, culturas neuronais, sinapstosas cerebrais, fatias cerebrais agudas ex vivo e animais inteiros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<s…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer