3D Beeldvorming van PDL Collageenvezels tijdens Orthodontische Tandbeweging in Mandibular Murine Model
Summary
We presenteren een protocol voor het genereren van orthodontische tandbeweging bij muizen en methoden voor 3D-visualisatie van de collageenvezels en bloedvaten van parodontale ligament zonder sectioning.
Abstract
Orthodontische tandbeweging is een complex biologisch proces van veranderde hermodellering van zacht en hard weefsel als gevolg van externe krachten. Om deze complexe remodelleringsprocessen te begrijpen, is het van cruciaal belang om de tand- en parodontale weefsels binnen hun 3D-context te bestuderen en daarom eventuele doorsneden en weefselartefacten te minimaliseren. Muismodellen worden vaak gebruikt in ontwikkelings- en structurele biologie, evenals in biomechanica vanwege hun kleine formaat, hoge stofwisseling, genetica en gebruiksgemak. In principe maakt dit ze ook uitstekende modellen voor tandheelkundige studies. Een grote belemmering is echter hun kleine tandgrootte, met name de kiezen. Dit artikel is gericht op het bieden van een stapsgewijs protocol voor het genereren van orthodontische tandbeweging en twee methoden voor 3D-beeldvorming van de parodontale ligamentfibulaire component van een muismandibulaire kies. De eerste gepresenteerde methode is gebaseerd op een micro-CT-opstelling die faseverbetering van verse collageenweefsels mogelijk maakt. De tweede methode is een botopruimingsmethode met ethylcinnamaat die beeldvorming door het bot mogelijk maakt zonder doorsneden en endogene fluorescentie behoudt. Het combineren van deze clearing methode met reporter muizen zoals Flk1–Cre; TdTomato bood een eerste in zijn soort gelegenheid om de 3D vasculatuur in het PDL- en alveolaire bot in beeld te krijgen.
Introduction
Het fundamentele onderliggende biologische proces in orthodontische tandbeweging (OTM) is botremodellering. De trigger voor dit remodelleringsproces wordt toegeschreven aan veranderingen in de structuur van het parodontale ligament (PDL) zoals extracellulaire matrix (ECM) stress, necrose evenals bloedvatvernietiging en vorming1,2,3. Andere mogelijke triggers voor alveolaire botremodellering zijn gerelateerd aan krachtdetectie door osteocyten in het bot, evenals mechanische vervorming van het alveolaire bot zelf; hun rol in OTM is echter nog steeds niet volledig opgehelderd4,5.
Ondanks vele studies die gericht waren op het onthullen van structuur-functierelaties van de PDL tijdens OTM , moet nog een duidelijk functioneel mechanisme worden gedefinieerd6,7. De belangrijkste reden hiervoor is de uitdaging bij het ophalen van gegevens van een zacht weefsel (PDL) tussen twee harde weefsels (cementum en alveolaire bot). De geaccepteerde methoden voor het verzamelen van structurele informatie vereisen meestal fixatie en doorsneden die de PDL-structuur verstoren en wijzigen. Bovendien leveren de meeste van deze methoden 2D-gegevens op die, zelfs als ze niet vervormd zijn, slechts gedeeltelijke en gelokaliseerde informatie geven. Aangezien de PDL niet uniform is in zijn structuur en functie, is een aanpak die de intacte 3D-structuur van het hele tand-PDL-botcomplex aanpakt gerechtvaardigd.
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van een OTM bij muizen en twee methoden die 3D-visualisatie van de collageenvezels in de PDL mogelijk maken zonder enige sectie van het monster.
Murinemodellen worden veel gebruikt voor in-vivo experimenten in de geneeskunde, ontwikkelingsbiologie, medicijnafgifte en structurele studies. Ze kunnen genetisch worden gemodificeerd om specifieke eiwitten en functies te elimineren of te verbeteren; ze zorgen voor snelle, herhaalbare en voorspelbare ontwikkelingscontrole; ze zijn ook gemakkelijk te beeld vanwege hun kleine formaat8. Ondanks hun vele voordelen worden muismodellen in tandheelkundig onderzoek niet vaak gebruikt, vooral wanneer klinische manipulaties gerechtvaardigd zijn, meestal vanwege de kleine tanden. Diermodellen zoals ratten9,10,11,honden12,13,varkens14,15,16 en apen17 worden vaker gebruikt dan muizen. Met de recente ontwikkeling van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie zijn de voordelen van het gebruik van een muismodel om de ingewikkelde processen in OTM te ontcijferen talrijk. Dit artikel presenteert een methode om een mesiale beweging van de kiestand in de onderkaak te genereren met constante krachtniveaus die botremodellering veroorzaken. De meeste OTM-experimenten bij knaagdieren worden gedaan in de maxilla, omdat de mobiliteit van de onderkaak en de aanwezigheid van de tong een ander complexiteitsniveau toevoegen. De onderkaak heeft echter veel voordelen wanneer 3D structurele integriteit gewenst is. Het kan gemakkelijk worden ontleed als een heel bot; bij sommige soorten kan het worden gescheiden in twee hemi-kaken door de vezelige symfyse; het is compact, plat en bevat alleen de tanden zonder sinusruimten. De maxilla is daarentegen een deel van de schedel en nauw verwant aan andere organen en structuren, dus uitgebreide doorsneden zijn nodig om het alveolaire bot met de bijbehorende tanden te ontleden.
Met behulp van een interne vochtigheidskamer gekoppeld aan een laadsysteem in een micro-CT met hoge resolutie die faseverbetering mogelijk maakt, ontwikkelden we een methode om verse vezelige weefsels in 3D te visualiseren zoals eerder beschreven9,18,19,20,21,22,23. Verse weefsels worden onmiddellijk gescand nadat het dier is geofferd zonder enige kleuring of fixatie, wat weefselartefacten en veranderingen van biomechanische eigenschappen vermindert. Deze 3D-gegevens kunnen worden gebruikt voor distributie- en richtingsanalyses van de vezels zoals elders beschreven19.
De tweede 3D-methode voor beeldvorming van hele weefsels die hier wordt gepresenteerd, is gebaseerd op optische clearing van de onderkaak, waardoor de PDL-vezels door het bot kunnen worden gebeeldbeerd zonder enige doorsnede. Interessant is dat het ook visualisatie van de collageenvezels van het bot zelf mogelijk maakt, maar dit zal hier niet worden besproken. Over het algemeen zijn er twee methoden voor weefselopruiming. De eerste is waterige clearing waarbij het monster wordt ondergedompeld in een waterige oplossing met een brekingsindex groter dan 1,4, hetzij door een eenvoudige onderdompeling, hyperhydratatie of hydrogelinbedding. Deze methode is echter beperkt in het niveau van transparantie en de structurele conservering van het weefsel en vereist daarom fixatie van het weefsel. De tweede methode die zeer transparante monsters oplevert en geen fixatie vereist , is de clearingmethode op basis vanoplosmiddelen 24,25. We hebben een gemodificeerde clearingmethode op basis van oplosmiddelen gegenereerd op basis van ethyl-3-fenylprop-2-enoaat (ethylcinnamaat, ECi) voor de mandibulaire monsters. Deze methode heeft de voordelen van het gebruik van niet-toxische voedselkwaliteit clearing agent, minimale weefselkrimp, en behoud van fluorescerende eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het genereren van OTM bij muizen is zeer gewenst vanwege de grootte, genetica en hanteringsvoordelen. Het gebruik van de onderkaak biedt een eenvoudige behandeling, zowel in termen van weefseldissectie als monstervoorbereiding en beeldvorming. Hier presenteerden we een methode om OTM te genereren met translationele beweging van de tand in het bot binnen 7 dagen na OTM. Met behulp van dit protocol kan de totale duur van de tandbeweging worden verlengd, omdat de geactiveerde spoel een constant krachtniveau levert voor bewe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). We willen Harvard Center for Biological Imaging bedanken voor infrastructuur en ondersteuning. Alle cijfers worden gegenereerd met biorender.com.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
Riferimenti
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
