下顎マウスモデルにおける歯歯運動中のPDLコラーゲン線維の3Dイメージング

Summary

マウスにおける歯の動きを発生させるプロトコルと、歯周靭帯のコラーゲン線維や血管の3D可視化法を、切り離さずに提示する。

Abstract

歯歯の運動は、外部力の結果として変化した軟部および硬い組織の複雑な生物学的プロセスである。これらの複雑なリモデリングプロセスを理解するためには、歯と歯周組織を3Dコンテキスト内で研究し、断面や組織のアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。マウスモデルは、小さなサイズ、高い代謝率、遺伝学、取り扱いの容易さから、発生生物学や構造生物学、バイオメカニクスにも利用されることが多い。原則として、歯科関連研究のための優れたモデルにもなります。しかし、大きな障害は、その小さな歯の大きさ、特に臼歯です。本論文は、マウス下顎臼歯の歯周靭帯線維成分の歯周歯周運動を生成するためのステップ・プロトコルと、3Dイメージングのための2つの方法を提供することを目的としている。最初に提示される方法は、新鮮なコラーゲン組織の位相増強イメージングを可能にするマイクロCTセットアップに基づいています。第2の方法は、切片をかけずに骨を通してイメージングを可能にし、内因性蛍光を保存するエチルシンナメートを用いた骨のクリアリング法である。 Flk1–Creのようなレポーターマウスとこのクリアリング方法を組み合わせる 。TdTomatoは、PDLと歯槽骨の3D血管構造を画像化するその種の機会の最初の機会を提供しました。

Introduction

歯歯運動(OTM)の基本的な基礎となる生物学的プロセスは骨のリモデリングである。このリモデリングプロセスのトリガは、細胞外マトリックス(ECM)ストレス、壊死、血管破壊および形成^1、2、3などの歯周靭帯(PDL)の構造の変化に起因する。歯槽骨リモデリングの他の可能なトリガーは、骨の骨細胞による力の感知に関連しています, だけでなく、歯槽骨自体の機械的変形;しかし、OTMにおける彼らの役割はまだ完全に解明されていません^4,5.

OTM中のPDLの構造機能関係を明らかにすることを目的とした多くの研究にもかかわらず、明確な機能機構はまだ^6,7に定義されていない。この主な理由は、2つの硬い組織(セメントと歯槽骨)の間にある軟部組織(PDL)のデータを取得する際の課題です。通常、構造情報を収集するメソッドは、PDL 構造を中断および変更する固定と断面化を必要とします。さらに、これらのメソッドのほとんどは、歪んでいなくても部分的な情報とローカライズされた情報のみを提供する2Dデータを生成します。PDLは構造と機能において均一ではないため、歯-PDL-骨複合体全体の無傷の3D構造に対処するアプローチが保証されています。

本論文では、マウスでOTMを生成する方法と、サンプルを切り離さずにPDL内のコラーゲン線維を3D可視化する2つの方法について説明する。

マウスモデルは、医学、発生生物学、薬物送達および構造研究におけるインビボ実験に広く使用されています。彼らは、特定のタンパク質と機能を排除または強化するために遺伝子組み換えすることができます。高速で再現可能で予測可能な開発制御を提供します。彼らはまた、その小さなサイズ8に画像を容易に^.多くの利点にもかかわらず、歯科研究におけるマウスモデルは、特に臨床操作が保証されている場合、主に小さな歯のために頻繁に使用されません。ラット^{9、10、11、}イヌ^12、13、豚^14、15、16およびサル¹⁷などの動物モデルは、マウスよりも頻繁に使用される。近年の高解像度イメージング技術の開発により、マウスモデルを利用してOTMの複雑なプロセスを解読する利点は数多くあります。本論文では、骨のリモデリングを引き起こす一定の力レベルを有する下顎骨の臼歯のメシャル運動を生成する方法を提示する。げっ歯類のOTM実験のほとんどは、下顎骨の移動性と舌の存在が別の複雑性レベルを追加するので、上顎で行われます。しかし、3D構造の完全性が望まれる場合には、下顎が多くの利点を有する。骨全体として簡単に解剖することができます。いくつかの種では、線維性の交付を介して2つの半下顎骨に分離することができます。それは密集し、平らであり、すべての内大なスペースのない歯だけを含んでいる。対照的に、上顎は頭蓋骨の一部であり、他の器官および構造と密接に関連しており、したがって、関連する歯茎骨を関連する歯槽骨を解剖するために広範な断面化が必要である。

位相増強を可能にする高分解能マイクロCT内のローディングシステムに結合した室内湿度室を用いて、先に述べた^とおりに新鮮な繊維組織を3Dで可視化する方法を開発^{しました。}新鮮な組織は、動物が染色や固定なしで犠牲にされた直後にスキャンされ、組織のアーティファクトや生体機械特性の変化を減らします。これらの3Dデータは、他の場所で説明されているように繊維の分布と方向分析に利用することができる^。

ここで紹介する第2の3D組織全体のイメージング方法は、切断することなく骨を通してPDL繊維のイメージングを可能にする下顎骨の光学的なクリアリングに基づいています。興味深いことに、骨自体のコラーゲン線維の視覚化も可能にしますが、ここでは議論されません。一般に、組織をクリアする方法は2つあります。1つ目は、単純な浸漬、過水性またはヒドロゲル埋め込みのいずれかを介して、1.4を超える屈折率を有する水溶液にサンプルが浸漬される水性の洗浄である水性ベースのクリアリングです。しかし、この方法は、組織の構造保存と同様に透明性のレベルに制限され、したがって、組織の固定を必要とします。高透明サンプルを生成し、固定を必要としない第2の方法は、溶媒ベースの清算方法^24,25である。下顎試料に対するエチル-3フェニルプロップ-2-エノエート(エチルシンナメート、ECi)に基づく修飾溶媒ベースのクリアリング法を生成した。この方法は、非毒性食品グレードのクリアリング剤、最小限の組織収縮、および蛍光タンパク質の保存を使用する利点を有する。

Protocol

すべての動物実験は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドラインとハーバード大学の施設動物のケアと使用委員会(議定書no.01840)のガイドラインに従って行われました。 1. 歯列歯運動 マウスベッドを生成するには、くさび状の45°斜めヘッドレストを備えた平らなプラスチックプラットフォームを使用してください。ヘッドレストはプラスチック製の箱を切?…

Representative Results

本論文では、OTMを作製する方法と、断面を全くつけずにPDL内部のコラーゲン繊維を3Dイメージングする方法を2つ紹介する。動物研究のために、歯の整列が必要でない場合、歯の動きは、すべての根のレベルで歯槽骨の改造を生成する場合、矯正と見なされます。信頼性の高いOTMを生成するためには、歯に適用される一定の力レベルが必要です。ここで、活性化された形状記憶NiTiコイルは、7?…

Discussion

マウスでOTMを生成することは、サイズ、遺伝学および取り扱いの利点のために非常に望ましい。下顎薬を使用すると、組織解剖の点で簡単に処理できるだけでなく、サンプル調製物およびイメージングを提供します。ここでは、OTMの7日以内に骨の中の歯の移動運動を伴うOTMを生成する方法を提示した。このプロトコルを使用すると、活性化コイルが約1mmまでの動きのための一定の力レベルを…

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2