Imágenes 3D De Fibras De Colágeno PDL Durante El Movimiento Dental Ortodoncia En El Modelo Murino Mandibular

Summary

Presentamos un protocolo para generar movimiento dental ortodóncico en ratones y métodos para la visualización 3D de las fibras de colágeno y vasos sanguíneos del ligamento periodontal sin seccionamiento.

Abstract

El movimiento ortodóncico de los dientes es un proceso biológico complejo de remodelación de tejidos blandos y duros alterados como resultado de fuerzas externas. Con el fin de entender estos complejos procesos de remodelación, es fundamental estudiar los tejidos dentales y periodontales dentro de su contexto 3D y, por lo tanto, minimizar cualquier seccionamiento y artefactos tisulares. Los modelos de ratón se utilizan a menudo en biología estructural y del desarrollo, así como en biomecánica debido a su pequeño tamaño, alta tasa metabólica, genética y facilidad de manejo. En principio esto también los convierte en excelentes modelos para estudios relacionados con la odontología. Sin embargo, un impedimento importante es su pequeño tamaño de diente, los molares en particular. Este papel se dirige proporcionando un protocolo paso a paso para generar el movimiento ortodóntico del diente y dos métodos para la proyección de imagen 3D del componente fibroso del ligamento periodontal de una muela de la mandíbula del ratón. El primer método presentado se basa en una configuración del micro-CT que permite la proyección de imagen del realce de la fase de los tejidos frescos del colágeno. El segundo método es un método del claro del hueso usando el cinnamato de etilo que permite la proyección de imagen a través del hueso sin seccionar y preserva fluorescencia endógena. Combinando este método de limpieza con ratones reporteros como Flk1–Cre; TdTomato proporcionó una primera oportunidad de su tipo para obtener imágenes de la vasculatura 3D en la PDL y el hueso alveolar.

Introduction

El proceso biológico subyacente básico en el movimiento ortodóntico del diente (OTM) es el remodelado del hueso. El desencadenante de este proceso de remodelación se atribuye a los cambios en la estructura del ligamento periodontal (PDL) como el estrés de la matriz extracelular (MEC), la necrosis, así como la destrucción y formación de los vasos sanguíneos^1,2,3. Otros posibles desencadenantes de la remodelación ósea alveolar están relacionados con la detección de fuerza por los osteocitos en el hueso, así como la deformación mecánica del propio hueso alveolar; sin embargo, su papel en OTM todavía no está completamente dilucidado^4,5.

A pesar de muchos estudios dirigidos a revelar las relaciones estructura-función de la PDL durante la OTM, aún no se ha definido un mecanismo funcional claro^6,7. La razón principal de esto es el desafío en la recuperación de datos de un tejido suave (PDL) situado entre dos tejidos duros (cemento y hueso alveolar). Los métodos aceptados para recopilar información estructural generalmente requieren fijación y seccionamiento que interrumpen y modifican la estructura de PDL. Además, la mayoría de estos métodos producen datos 2D que, incluso si no están distorsionados, solo dan información parcial y localizada. Puesto que el PDL no es uniforme en su estructura y función, un acercamiento que aborde la estructura intacta 3D del complejo entero del diente-PDL-hueso se autoriza.

Este trabajo describirá un método para generar un OTM en ratones y dos métodos que permiten la visualización 3D de las fibras de colágeno en la PDL sin ningún seccionamiento de la muestra.

Los modelos murinos son ampliamente utilizados para experimentos in vivo en medicina, biología del desarrollo, administración de fármacos y estudios estructurales. Pueden ser modificados genéticamente para eliminar o mejorar proteínas y funciones específicas; proporcionan un control del desarrollo rápido, repetible y predecible; también son fáciles de imagen debido a su pequeño tamaño^8. A pesar de sus muchas ventajas, los modelos de ratón en la investigación dental no se utilizan con frecuencia, especialmente cuando se justifican manipulaciones clínicas, sobre todo debido a los dientes de pequeño tamaño. Los modelos animales como ratas^9,10,11,perros^12,13,cerdos^14,15,16 y monos¹⁷ se utilizan con más frecuencia que los ratones. Con el reciente desarrollo de técnicas de imagen de alta resolución, las ventajas de utilizar un modelo de ratón para descifrar los procesos enrevesados en OTM son numerosas. Este papel presenta un método para generar un movimiento mesial del diente molar en la mandíbula con los niveles constantes de la fuerza que accionan el remodelado del hueso. La mayoría de los experimentos OTM en roedores se realizan en el maxilar, ya que la movilidad de la mandíbula y la presencia de la lengua añaden otro nivel de complejidad. Sin embargo, la mandíbula tiene muchas ventajas cuando se desea la integridad estructural 3D. Se puede diseccionar fácilmente como un hueso entero; en algunas especies se puede separar en dos hemi-mandíbulas a través de la sínfisis fibrosa; es compacto, plano y contiene sólo los dientes sin espacios sinusales. En cambio, el maxilar es una parte del cráneo y estrechamente relacionado con otros órganos y estructuras, por lo que se necesita un seccionamiento extenso para diseccionar el hueso alveolar con los dientes asociados.

Utilizando una cámara de humedad en la casa acoplada a un sistema de carga dentro de un micro-CT de alta resolución que permite la mejora de fase, desarrollamos un método para visualizar tejidos fibrosos frescos en 3D como se describió anteriormente^{9,18, 19,20,21,22,23.} Los tejidos frescos se escanean inmediatamente después de que el animal es sacrificado sin ninguna mancha o fijación, lo que reduce los artefactos tisulares, así como las alteraciones de las propiedades biomecánicas. Estos datos 3D pueden ser utilizados para análisis de distribución y dirección de las fibras como se describe en otra parte¹⁹.

El segundo método 3D entero de la proyección de imagen del tejido presentado aquí se basa en el claro óptico de la mandíbula que permite la proyección de imagen de las fibras de PDL a través del hueso sin ninguna seccionamiento. Curiosamente también permite la visualización de las fibras de colágeno del hueso en sí, sin embargo, esto no se discutirá aquí. En general, hay dos métodos para la limpieza de tejidos. El primero es el claro a base acuosa donde la muestra se sumerge en una solución acuosa con un índice de refracción superior a 1,4 ya sea mediante una simple inmersión, hiperhidratación o incrustación de hidrogel. Sin embargo, este método está limitado en el nivel de transparencia, así como la preservación estructural del tejido y por lo tanto requiere la fijación del tejido. El segundo método que produce muestras altamente transparentes y no requiere fijación es el método de limpieza a base de^{disolventes 24,25}. Se generó un método modificado de compensación a base de solventes basado en etil-3-fenilprop-2-enoato (cinamato de etilo, ECi) para las muestras de la mandíbula. Este método tiene las ventajas de usar el agente de claro no tóxico del alimento-grado, la contracción mínima del tejido, y la preservación de proteínas fluorescentes.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Harvard (Protocolo nº 01840). 1. Movimiento dental ortodóncico Para generar una cama de ratón, utilice una plataforma de plástico plana con un reposacabezas en forma de cuña, 45 ° en ángulo. El reposacabezas se puede generar cortando una caja…

Representative Results

Este papel presenta un método para producir OTM así como dos métodos para la proyección de imagen 3D de las fibras del colágeno dentro del PDL sin ninguna seccionamiento. Para fines de investigación animal, cuando la alineación de los dientes no es necesaria, un movimiento dental se considera ortodoncia si genera la remodelación del hueso alveolar en todos los niveles de la raíz. Se requiere un nivel de fuerza constante aplicado en los dientes para generar un OTM confiable. Aquí, una bobina de NiTi de memoria d…

Discussion

La generación de OTM en ratones es muy deseada debido al tamaño, la genética y las ventajas de manejo. El uso de la mandíbula proporciona un fácil manejo tanto en términos de disección de tejidos como de preparación de muestras e imágenes. Aquí presentamos un método para generar OTM con el movimiento de traslación del diente dentro del hueso en el plazo de 7 días de OTM. Usando este protocolo, la duración total del movimiento del diente se puede extender, ya que la bobina activada entrega un nivel de fuerza…

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2