Summary
Bu protokolün amacı, Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır.
Abstract
Drosophila melanogaster yumurtalıklarının canlı görüntülenmesi, ribonikleoprotein parçacık hareketi, mRNA lokalizasyonu, organel hareketi ve sitoskeletal dinamikler de dahil olmak üzere gelişim sırasında çeşitli temel hücresel süreçlerin anlaşılmasında etkili olmuştur. Canlı görüntüleme için geliştirilmiş çeşitli yöntemler vardır. Her yöntemin medyaya veya halokarbon yağına yerleştirilen bireysel ovariolelerin diseksiyonu içermesi nedeniyle, hipoksi ve / veya fiziksel manipülasyona bağlı hücresel hasar kaçınılmaz olarak zamanla ortaya çıkacaktır. Hipoksinin aşağı yönlü etkilerinden biri hücrelerdeki oksidatif hasarı arttırmaktır. Bu protokolün amacı, kontrollü hücresel hasarın indüksiyonu sonrasında Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır. Burada, hücresel oksidatif hasara neden olmak için hidrojen peroksit kullanıyoruz ve bu tür hasarın iki hücre altı yapı, mitokondri ve Clu mutluluk parçacıkları üzerindeki etkilerinden örnekler veriyoruz. Ancak, bu yöntem herhangi bir alt hücre yapısı için geçerlidir. Sınırlamalar, hidrojen peroksitin sadece sulu ortamlara eklenebilmesi ve halokarbon yağı kullanan görüntüleme için çalışmamasıdır. Avantajları, hidrojen peroksitin kolayca kullanılabilir ve ucuz olması, hızlı hareket etmesi, konsantrasyonlarının modüle edilebilmesi ve oksidatif hasarın, manipülasyona bağlı genel doku hasarının yanı sıra hipoksinin neden olduğu hasarın iyi bir yaklaşık olmasıdır.
Introduction
Doku ex vivo'nun deneysel kültürü ve manipülasyonu sırasında ısı şoku, oksidatif stres, ozmotik stres, beslenme stresi ve toksisite koşulları dahil olmak üzere birden fazla farklı hücresel stresör ortaya çıkabilir. Canlı görüntüleme, deneysel tedavi ve manipülasyondan sonra ex vivo dokulardaki gerçek zamanlı değişiklikleri görselleştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. İnce doku diseksiyonları ve manipülasyon pratik alır ve diseksiyondan görüntülemeye kadar geçen süre deneyime bağlı olarak değişebilir. Bu yöntemi geliştirmenin gerekçesi, canlı görüntüleme için doku hazırlamanın diseksiyon ve görüntüleme hazırlığı sırasında hücresel strese neden olabileceği endişesine dayanmaktadır. Bu, hücresel metabolizmadaki değişikliklere ve mitokondriyal fonksiyon gibi mevcut oksijen seviyelerine duyarlı süreçler için özellikle sorunlu olabilir. Paralel vahşi tip bir örneğe sahip olmak önemli bir kontrol olmakla birlikte, hücre altı yapılarda gözlenen değişikliklerin bir kısmının veya tamamının diseksiyondan kaynaklanan hasar veya hücre stresinden kaynaklanabileceği ve normal fizyolojiyi veya çalışılan tedaviyi veya mutasyonu yansıtmadığı olasılığı hala vardır.
Bu potansiyel sorunu gidermek için, hücresel oksidatif hasara neden olmak için canlı görüntüleme sırasında hidrojen peroksit ilavesi kullanıyoruz1. Bu yöntemin amacı, hücre altı yapılar üzerindeki etkiyi izlemek için dokulara zarar vermektir. Bu protokol iki amaç için yararlıdır: 1) ilgi yapısının hücre altı lokalizasyonundaki değişikliklerin deneyimsiz diseksiyonun neden olduğu strese bağlı olup olmadığını belirlemek ve 2) araştırmacı kontrollü stresin ilgi yapısı üzerindeki etkisini izlemek için açıklanan diseksiyon tekniklerinden emin olduğunda. Burada artan oksidatif hasarın iki hücre altı yapıda, mitokondri ve Clu saadet parçacıklarında nasıl değişikliklere neden olduğuna dair iki örnek gösteriyoruz. Bunu yapmak için canlı görüntüleme çalışmaları için yaygın bir model olan Drosophila yumurtalığını kullanıyoruz. İlk örnek mitokondriyal lokalizasyonu inceler. Deneyimlerimize göre, kadın mikrop hücrelerinde normal mitokondriyal lokalizasyon pertürbasyonlara karşı oldukça hassastır ve hücresel stresin habercisi olarak işlev görebilebilir. Drosophila kadın mikrop hücrelerindeki mitokondri normalde sitoplazma boyunca eşit olarak dağılır2. Hidrojen peroksit ilavesi, organellerin çeşitli mutasyonlara benzer şekilde hızla yanlış ölçeklenmesine ve kümelenmesine neden olur3,4,5. İkinci örnek Clueless (Clu) tarafından oluşturulan saadet parçacıklarıdır. Clu sitoplazma boyunca yaygın olan bir ribonucleoproteindir; bununla birlikte, optimal hücresel koşullar altında mitokondri ile ilişkili parçacıklar da oluşturur5. Clu parçacıklarının varlığı sağlıklı hücresel koşullara bağlı olduğundan, onları "mutluluk" parçacıkları3,5,6. Hidrojen peroksit ilavesi, bu parçacıkların hızla dağılmasına ve sitoplazmda homojen hale gelmesine neden olur5. Çalışmalarımız boyunca, bu hücre altı yapıların her ikisinin lokalizasyonunda değişiklikler gözlemledik, ancak ancak canlı görüntüleme çalışmaları yaptıktan sonra hücresel stres ve oksidatif hasarın mitokondri ve saadet parçacıklarının lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki etkisini tam olarak takdir edebiliriz.
Bu protokolün zaten belirlenmiş veya alternatif yöntemlere ek olarak yardımcı programı çeşitli faktörlere bağlıdır. İlk olarak, görüntüleme protokolü ilaç eklemeye uygun olmalıdır. Numune bir kapak kılıfı altına ve halokarbon yağına monte edilmişse, bu yöntem mümkün olmayacaktır7. H2O2 ilavesi oksidatif hasarda hızlı bir artışa neden olur, bu nedenle bu zaman ölçeği uygun olmayabilir. Oksidatif hasar hipoksi için bir proxy olarak kabul edilebilir; ancak, belirli hücre altı bileşenler için hasar için uygun bir kontrol olarak çalışmak için çok sert veya çok genelleştirilmiş olabilir. Son olarak, bir gelişim sürecini izleyenler gibi saatler süren görüntüleme deneyleri için, H2O2 ilavesi çok güçlü olabilir (örneğin8). Bir konsantrasyon eğrisini test etmek bu sınırlamayı aşabilir.
Protocol
1. Diseksiyon ve görüntüleme ortamlarının hazırlanması
NOT: Bu canlı görüntüleme deneyi için en uygun medya, Schneider'ın Drosophila medyasını içerir ve bundan sonra Complete Schneider'ın medyası olarak anılacaktır.
- Kontamine olmadığından emin olmak için ortam hazırlığını steril koşullar altında gerçekleştirin. Medya, Drosophila ovarioles'i uzun süre desteklemek için geliştirilmiştir9.
- Schneider'ın medyasına %15 ısı inaktive fetal sığır serumu, 0,6x Pen-Strep ve 200 μg/mL sığır insülini ekleyin.
- İçeriği iyice karıştırın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
NOT: İnsülin Tam Schneider medyasında tamamen çözülmez ve tüpün altına bir çökeltinin yerleştiğini fark edeceksiniz. - Görüntülemeye engel olacağı için çökeltmeden ayrıldığından emin olarak medyanın aliquotlarını yapın.
NOT: Bu çözelti 4 °C'de aliquotlarda saklanırsa bir ay içinde kullanılabilir.
2. Diseksiyon için Drosophila Koleksiyonu
NOT: Ayrıntılı Drosophila toplama ve diseksiyon prosedürleri Weil ve ark.10 ve Parker ve ark.11'dede bulunabilir.
- Optimal dişi mikrop hücresi görüntüleme için, önce standart mısır unu sinek maması içeren bir şişe ve fıstık ezmesi kıvamı olan bir dab ıslak maya ezmesi hazırlayın. Bu, dişi sineklerin iyi beslenmesini sağlar ve görüntüleme için tüm folikül gelişim aşamalarını üretecektir.
- En sağlıklı sinekler için, 0-1 günlük dişileri toplayın ve erkeklerle birlikte ıslak maya macunu içeren bir sinek gıda şişesine aktarın.
NOT: Uyuyan sineklerin maya ezmesine yapışabilecekleri için temas etmediklerine emin olun. - Sinekleri 3-7 gün besleyin, şişeyi ve maya ezmesini günlük olarak değiştirir.
NOT: Maya ezmesinin sinek yiyeceğini kurumaması için temasa geçtiğinden emin olun.
3. Drosophila yumurtalık diseksiyonu
NOT: Hidrojen peroksit oksidasyona duyarlı olduğundan ve TMRE zamanla bozulduğundan, medya çözümlerini taze hazırlamak önemlidir.
- Diseksiyondan hemen önce, Complete Schneider'ın medyasında, 2 μM H2O2 çözeltisinden oluşan taze bir aliquot, 46 nM tetrametrirhodamin, etil ester (TMRE) taze bir aliquot ve 2 μM H 2 O2içeren 46 nM TMRE çözümünün taze bir aliquot'unu hazırlayın.
- Yumurtalık diseksiyonu için, iki çift ince forseps ve bir çift elektrolitik olarak keskinleştirilmiş tungsten iğnesi kullanın12. Yumurtalıkları parçalamak için, bir cam alt diseksiyon kabının (saat camı) 2-3 kuyusunu oda sıcaklığına ısıtılmış Complete Schneider's ile doldurun.
- Besili sinek şişesini karbondioksit ile uyuşturun ve incelenecek istenen sayıda dişi sinek ayırın. Kümes uçlarını kullanarak medyaya tek bir sinek yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir çift ince toka kullanarak sineği toraksla hafifçe kavrayın. Diğer çift toparlama ile arkayı kavrayın ve yumurtalıkları çıkarmak için hafifçe çekin.
NOT: Yumurtalıklar bu yöntem kullanılarak sorunsuz bir şekilde çıkmazsa, tüm karın sinekten de çıkarılabilir ve yumurtalıklar önps kullanılarak karnın her iki ucundan hafifçe sıkılabilir. - Herhangi bir yabancı manikür veya dokuyu çıkarın, ardından yumurtalıkları taze ortam içeren yeni bir kuyuya aktarın. Yumurtalıklar hala çevredeki kas kılımından hareket ediyor olmalıdır.
4. Görüntüleme için yumurtalıkların hazırlanması
- Keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanarak, çevredeki kas kılımını çıkarmaya özen ederek yumurtalıkları hafifçe kızdırın (Şekil 1).
- İzole yumurtalıklara bağlı kas kılımlarını ve sinir liflerini hafifçe kızdırın (Şekil 2).
NOT: Kas kılıma çıkarılmazsa, yumurtalık seğirir ve hareket eder ve görüntü alımında sorunlara neden olur (Video 1). - İlgi çekici hücre altı yapılar endojen olarak etiketlenmişse, Adım 4.4'e geçin. İlgi çekici yapılar floresan boya ile etiketlenecekse, Bölüm 5'e geçin.
- Yumurtalıklar temiz bir şekilde parçalandıktan sonra, bir mikropipette kullanarak, Bunları Complete Schneider'ın görüntüleme medyasının 100 μL'lik bir damlasında cam bir alt kabın cam eğimine aktarın. Bireysel yumurtalıklar damlacıkların dibine batacaktır.
- Görüntüleme için Bölüm 6'ya geçin.
NOT: Mitokondri ve Clu mutluluk parçacıklarının görüntülenmesi için diseksiyonun başlangıcından görüntülemeye kadar en fazla beş-on dakika geçmesi gerekir.
5. TMRE ile mitokondri boyama
NOT: Mitokondrilerin floresan boyalarla canlı boyanmalarıyla ilgili ek ayrıntılı prosedürler Parker ve ark.
- 4.3. adımdan sonra, izole edilmiş ovarioles'i 46 nM TMRE ortamın 100 μL'lik bir damlasında cam bir alt kabın cam eğimine aktarın. Bireysel yumurtalıklar damlacıkların dibine batacaktır.
- Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Kapağı cam tabanlı kabın üzerine yerleştirin ve çanağı ışıktan korumak için deney süresince kapalı bir kutuya yerleştirin.
NOT: Kuluçkadan sonra, numuneler doğrudan yıkama olmadan görüntülenebilir. - En az iki TMRE etiketli yumurtalık yemeği hazırlamak için 5.1-5.2 adımlarını tekrarlayın, biri deneysel bir grup olarak ve diğeri kontrol görevi görmek için.
6. Canlı görüntü alımı
- Yumurtalıklar monte edildikten sonra, cam alt tabaklardan birini mikroskopa yerleştirin ve görüntüleme parametrelerini gerektiği gibi yapılandırın. Burada kullanılan TMRE için optimum ekscitasyon/emisyon dalga boyları 549 nm/574 nm'dir.
- İstenilen görüş alanını bulduktan sonra, tedavi öncesi koşulların bir kaydı olarak istenildiği gibi bir veya daha fazla yumurtanın durağan görüntülerini veya kısa videolarını alın.
7. Görüntüleme sırasında hidrojen peroksit ilavesi
- Canlı görüntülemeyi duraklatın, kapağı cam alt tabaktan çıkarın ve endojen olarak etiketlenmiş yapıları görüntülemeniz durumunda bir mikropipette kullanarak yemeğedikkatlice100 μL 2 μM H 2 O 2 çözelti ekleyin. Mitokondrileri görüntülüyorsanız, bir mikropipette kullanarak yemeğe 2 μM H 2 O 2 çözeltili46 nMTMRE'nin 100 μL'lik kısmını dikkatlice ekleyin (Video 2).
- Mevcut medya damlacık yüzeyini kırmaktan veya yemeğin altında kalan yumurtalıkları yerinden etmemek için çözeltiyi çok hızlı eklemekten kaçının (Video 2).
- Bulaşık kapağını (bulaşık örtüsü) değiştirin, gerekirse istediğiniz görüş alanını yeniden yerleştirin ve yeniden odaklayın ve görüntülemeye devam edin (Video 3, Video 4, Şekil 3, Şekil 4).
- Deneysel tedavi zamana duyarlı olduğu için H2O2 ilavesi sonrasında görüntülemeye mümkün olduğunca çabuk devam etmeye özen gösterirsiniz (Video 5).
- İstenildiği gibi bir veya daha fazla yumurtalıkların durağan görüntülerini veya kısa videolarını alın. Bu, tedavi sonrası koşulların bir kaydı olarak hizmet edecektir.
- Kontrol için, ikinci cam alt kabı mikroskopa yerleştirin ve Bölüm 6'yı tekrarlayın.
- 7.1 adımını tekrarlayın, bu sefer çanağa 100 μL TMRE-only ortam ekleyin. Görüntüleme endojen olarak etiketlenmiş yapılar ise, Complete Schneider'ın yalnızca medya çözümünden 100 μL ekleyin.
- Denetim grubunun verilerini almak için 7.2 ve 7.3 adımlarını yineleyin.
NOT: Mitokondri ve Clu saadet partiküllerinin görüntülenmesi için, görüntülemeye hidrojen peroksit eklenmesinden en fazla üç-beş dakika geçmesi gerekir.
Representative Results
Açıklanan protokoller, Drosophila yumurtalıklarının canlı görüntülenmesi sırasında hidrojen peroksitin etkilerini incelemek için kullanılabilir. Şekil 3, Şekil 4, Video 3 ve Video 4'te gösterildiği gibi, bu prosedür deneysel tedaviden sonra doku değişikliklerini ve dinamiklerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için etkili bir araç sağlar. Daha da önemlisi, bu protokol görüntüleme sırasında yumurtalıklara H2O2 eklenmesi için özeldir; bununla birlikte, diğer ilaçların veya ilgi çekici reaktiflerin eksojen eklenmesi için uyarlanabilir. Ek olarak, foliküller görüntülemeden önce herhangi bir floresan boya ile etiketlenebilir (örneğin, tetrametilrhodamin (TMRE), LysoTracker). Net görüntüleme sonuçları elde etmenin en kritik adımları 1) tüm kontrantil elementler çıkarılmış tek yumurta sürülerinin uygun diseksiyonu ve izolasyonu (Şekil 1 ve Şekil 2) ve 2) hidrojen peroksit ilavesi sonrasında görüntülemenin yeniden başlatılma hızıdır. Video 4, görüntüleme süresi boyunca video 1'e kıyasla sabit kalan düzgün bir şekilde parçalanmış bir folikül çizimidir Görüntüleme sırasında görüş alanından çıkan kötü parçalanmış bir folikül gösterir. Video 5, TMRE etiketli mitokondri üzerindeki H2O2 etkilerinin, çok fazla zaman geçmesi sonucu görüntüleme başlamadan önce zaten ilerlediği bir çizimdir. Hidrojen peroksit ilavesi (zaman 0) ve bozulmamış, dağınık mitokondriler hala görülebilir olduktan hemen sonra görüntülemenin yeniden başlatıldığı Video 3 ile karşılaştırıldığında, Video 5'teki mitokondri, görüntülemenin yeniden başlatılmasıyla gözle görülür bir şekilde topaklanmaya ve membran potansiyelini kaybetmeye başladı. Bu sorun çoğunlukla H2O 2 ilavesi sırasında örnek konumların bozulmasına atfedilir ve görüntüleme medyasını ve örnek konumunu sağlam tutma tekniğini izleyerek hafifletilebilir (Video 2). Not olarak, medyaya H2O2 eklenmeden yapılan kontrol deneylerinde, foliküllerdeki mitokondri düzgün bir şekilde dağılır ve TMRE boyası mitokondrilerde inzyonda kalır.
Şekil 1: Drosophila yumurtalıklarından tek yumurtalıkların izolasyonu. (A) Bir çift yumurtalık, ucunda germarium (ok ucu) olan tek bir ovariole (ok) ve ovariole (kahverengi, epitel) ve yumurtalığı (kahverengi, periton) çevreleyen iki kas kılıfanı gösteren karikatür. (B) Diseksiyonlu Drosophila yumurtalığı. (C) Alay edilen yumurtalığın daha sonra bireysel yumurtalıklara ayrılması (ok). Ölçek çubuğu = 100 um. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sinir liflerinin ve kontral elementlerin tek ovariolelerden uzaklaştırılması. (A) Sinir dokusu kalıntıları ve kas kılıfası hala bağlı olan tek ovariole (ok). (B) A (ok) içinde ovariole bağlı kalan tüm dokunun nazik bir şekilde çıkarılması. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: H2O2 mitokondriyal yanlış hesaplamaya neden olur. (A-A") İyi beslenen bir cluCA06604 (Clu::GFP uçar) folikülünün canlı görüntü halatları. H2O2'nin eklenmesi mitokondrilerin görüntüleme süresi boyunca topaklanmalarına neden olur. Mitokondrilerin TMRE etiketlemesi, mitokondrilerin başlangıçta 0 (A) zamanlarında dağıldığını ve mitokondrilerin H 2 O2ilavesi (A′) sonra topaklanmaya başladığını gösterir, daha sonraki bir zaman noktasında, TMRE etiketlemesi mitokondrilerin zar potansiyelini kaybetmesi ve bu nedenle boyayı (A" )inzyon etme yetenekleri nedeniyle sivilceli hale gelir. Beyaz = TMRE (A-A"). Ölçek çubukları: A-A"5 için 10μminç ( A ) . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: H2O2, Clu'ya dağıtır. (A-A") İyi beslenen bir cluCA06604 folikülünün canlı görüntü görüntüleri. H2O2'nin eklenmesi, görüntüleme süresi boyunca parçacıkların dağılmasına ve sitoplazmada homojen hale gelmesine neden olur. Beyaz = Clu::GFP (A-A"). Ölçek çubuğu: A-A"5 için 40μminç ( A ) . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Bir cluCA06604 dişi folikül. Şekil 2'deaçıklandığı gibi, sinir lifi kontrtil elementlerinin tek yumurtalıklardan çıkarılmaması, görüntüleme sırasında yumurtalıkların belirgin sürüklenmesine ve hareket etmesine ve daha sonra görüntüleme verilerini analiz edememesine neden olacaktır. Beyaz = Clu::GFP. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Numune kabına H2O2'nin uygun şekilde eklenmesi. Numune kabına uygun boyutta bir mikropipette kullanılarak hidrojen peroksit eklenmelidir. Ortam yüzeyi kırılmadan H2O2 dağıtılıyor. Hidrojen peroksit ilavesi sırasında numune sürüklenmesini en aza indirmek için görüntüleme ortamlarının yüzeyinin kırılmaması için dikkatli olunmasına özen edilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 3: TMRE etiketli foliküllerin görüntülenmesi sırasında H2 O2 ilavesi. TMRE ile boyanmış bir cluCA06604 dişi folikül. H2O2, Drosophila foliküllerinde mitokondriyal yanlış hesaplamaya neden olur. Beyaz = TMRE boyası. 20 dakika boyunca 15 s'de bir kare görüntülenmiştir ve video saniyede 10 karedir5. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 4: Clu::GFP foliküllerinin görüntülenmesi sırasında H2O2 ilavesi. Bir cluCA06604 dişi folikül. H2O2, Şekil 4'teaçıklandığı gibi Clu parçacıklarını dağıtır. Beyaz = Clu::GFP. 15 dakika boyunca 15 sn'de bir kare görüntülenmiştir ve video saniyede 10 karedir. 5Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 5: H2O2 ilavesi sonrası gecikmeli görüntüleme. Bir cluCA06604 dişi folikül. Foliküllere hidrojen-peroksit eklenmesi zamana duyarlı bir işlemdir. H2O2 ilavesi sırasında örnek yer değiştirmesi sonucu bu videoda görüntülemenin yeniden başlatılması ertelendi. Mitokondriler, görüntülemenin 0 zamanında yeniden başlatılması üzerine gözle görülür bir şekilde topaklanmaya ve membran potansiyellerini kaybetmeye başladı (Video 3'teki 0 zamanına kıyasla). Tedaviden sonra görüntülemeye hızlı bir şekilde devam edilmemesi, görüntülemeden önce erken deneysel etkiler kaçırılacağı için yanlış ve kullanılamaz sonuçlara neden olacaktır. Beyaz = TMRE. 20 dakika boyunca 15 sn'de bir kare görüntülenmiştir ve video saniyede 10 karedir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, herhangi bir canlı görüntüleme deneyi için yumurtalık diseksiyonu ve doku inkübasyonu nedeniyle eserler için bir kontrol olarak yararlı bir ek olabilir. Kritik adımlar, diğer canlı görüntüleme protokolleri için bulunanlara benzer. Tüm Drosophila yumurtalıklarının nasıl inceldiğini öğrenmek pratik gerektirir; ancak, bu beceri genellikle uygun diseksiyon araçları ile oldukça hızlı bir şekilde öğrenilebilir. Ustalaşması daha zor yumurtalıkları saran kası çıkarmaktır ve her ovariole13. Bu, kas kasılmalarının görüntü alımını engellememesi için yapılmalıdır. Bunu yapmak için keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanmak başarılı olmazsa, ovariole'nin ucundaki germarium,ps ve kas kılımından çekilen yumurtalık ile kavranabilir. Ancak en erken gelişim evreleri hasar görebildikleri için incelenecekse bu teknik sorunludur. Bir diğer önemli adım, H 2O2eklerken çanağın altında dinlenmiş ovarioles yerinden çıkmamaktır. Ek bir önemli husus tüm canlı görüntüleme tarafından paylaşılmıştır: araştırmacı, tedaviden önce ilgi yapısının floresan olarak iyi etiketlenmiş olduğundan emin olmalıdır. Burada kullanılan yemekler (Malzeme Masası) canlı görüntüleme için yaygın olarak kullanılır; bununla birlikte, altta cam bir kapakçık veya hatta büyük bir cam kapaklı herhangi bir çanak veya slayt, medya buharlaşmasını önlemek için ortam damlası kapsanabildiği sürece çalışmalıdır. Belirli bir mikroskop kullanırken, söz konusu hücre altı yapıyı ve yeterli çözünürlük ve görüntü yakalama hızına sahip ekli bir kamerayı görmek için yeterli büyütme hedefine sahip herhangi bir ters mikroskop çalışmalıdır.
Laboratuvarımız öncelikle mitokondriyal fonksiyonla ilgilenirken, bu yöntem çekirdek, sitoskeleton veya endoplazmik retikulum gibi herhangi bir hücre altı yapının veya organellerin dinamiklerini ve lokalizasyonunu incelemek yararlı olabilir. Ancak, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Hidrojen peroksit eklemek için, doku sulu bir ortamda olmalıdır. Canlı görüntüleme için alternatif bir yöntem, bir model organizmada GFP'nin dinamik hareketinin ilk örneği de dahil olmak üzere Drosophila ovarioles'teki birçok önemli süreci tanımlamada etkili olan halokarbon yağı kullanmaktır7,14. Ek olarak, medyaya hidrojen peroksit eklemek, özellikle gelişimi inceleyen daha uzun deneyler için, ilgi çekici hücresel süreç için bilgilendirici olamayacak kadar genel bir dokuya hakaret olabilecek geniş yayılmış oksidatif hasara neden olur. Bu hızlı, kapsamlı ve muhtemelen geri dönüşü olmayan oksidatif hasar nedeniyle hücrenin uzun süreler boyunca görselleştirilmesini gerektiren deneyler yapmak mümkün olmasa da, tarif ettiğimiz akut hidrojen peroksit tedavisinin, görüntüleme süresi içinde çoğu aşamada aynı etkileri görebildiğimiz için oogenezisin çoğu aşaması için geçerli olduğunu gördük. Protokolün düşük maliyeti ve kolaylığı göz önüne alındığında, hasar için yararlı bir kontrol olabilir ve fiksasyon ve antikor etiketlemesinden önce bir tedavi olarak da kullanılabilir.
Elimizde H2O2 tedavisi, çeşitli Drosophila mutantlarında gördüğümüz mitokondriyal yanlış hesaplama ve Clu saadeti parçacık dağılımındaki değişiklikleri taklit eder. Ayrıca laboratuvarda diseksiyon tekniklerini öğrenen yeni araştırmacılar için gördüğümüz sonuçları taklit eder. Bu nedenle, bu yöntem, örnek hazırlama ve genel hücresel stresin mitokondriyal yanlış hesaplamada beklenmedik ve daha önce açıklanamayan değişikliklere ve mutluluk parçacıklarının varlığına yol açabileceğini açıkça ortaya koydu. Bu tekniği ileriye taşıyarak, hidrojen peroksit konsantrasyonları daha yüksek veya daha düşük bir konsantrasyon kullanılarak modüle edilebilir. Daha düşük bir konsantrasyon kullanılarak hücresel bir etki görülürse, ortamı Complete Schneider's ile değiştirerek stres fenotipinin tersine çevrilebilir olması mümkündür. Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP), arsenit veya basit ısı şoku gibi farklı hücre stresörleri, diğer hücre altı yapılar için genel hücresel stres için yararlı olabilir. Ex vivo dokuların canlı görüntülenmesi farklı ortamlarda manuel manipülasyon ve inkübasyon gerektirdiğinden, bu kontrol herhangi bir gözlemin normal fizyolojiye mümkün olduğunca yakın olmasını sağlamak için yararlı bir ek olmalıdır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Görüntüleme desteği için Dr. Jeremy Smyth'e ve illüstrasyonlar, prodüksiyon ve videografi için Ann C. Shenk'e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R01GM127938 ila R.T.C.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
