Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane
Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall’epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.
Abstract
La dissociazione cellulare è stata una procedura essenziale per gli studi a livello di singola cellula e/o a livello di popolazione cellulare (ad esempio, sequenziamento dell’RNA a singola cellula e coltura cellulare primaria). Produrre cellule vitali e sane in grandi quantità è fondamentale e le condizioni ottimali per farlo sono dipendenti dai tessuti. Le popolazioni cellulari nell’epitelio della lingua e nel mesenchima sottostante /tessuto connettivo sono eterogenee e le strutture tissutali variano in diverse regioni e in diversi stadi di sviluppo. Abbiamo testato protocolli per isolare le cellule dall’epitelio della lingua del topo e dal mesenchima / tessuto connettivo nelle prime fasi di sviluppo [giornata embrionale 12.5 (E12.5)] e giovani adulti (8 settimane). Una separazione netta tra l’epitelio e il mesenchima/tessuto connettivo sottostante era facile da realizzare. Tuttavia, per elaborare e isolare ulteriormente le cellule, producendo cellule sane vitali in grandi quantità e un’attenta selezione del buffer di digestione enzimatica, del tempo di incubazione e della velocità e del tempo di centrifugazione sono fondamentali. L’incubazione di epitelio separato o mesenchima/tessuto connettivo sottostante nello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 30 min a 37 °C, seguita da centrifugazione a 200 x g per 8 min ha portato a un alto rendimento delle cellule ad un alto tasso di vitalità (>90%) indipendentemente dalle fasi del mouse e dalle regioni della lingua. Inoltre, abbiamo scoperto che sia le cellule del tessuto epiteliale dissociato che mesenchimale /connettivo dalle lingue embrionali e adulte potrebbero sopravvivere nel mezzo a base di coltura cellulare per almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. I protocolli saranno utili per studi che richiedono la preparazione di cellule isolate dalle lingue del topo nelle prime fasi di sviluppo (E12.5) e giovani adulti (8 settimane) che richiedono la dissociazione cellulare da diversi compartimenti tissutali.
Introduction
La lingua dei mammiferi è un organo complesso critico per il gusto, il parlare e la lavorazione degli alimenti. È composto da più tipi di tessuti altamente organizzati compartimentati da mesenchima / tessuto connettivo e coperti da un foglio epiteliale stratificato contenente papille gustative e papille gustative. Le popolazioni cellulari sia nell’epitelio della lingua che nel mesenchima/tessuto connettivo sono eterogenee. Per comprendere meglio le funzioni e la distribuzione di un particolare tipo di cellule nella lingua, sono necessari studi utilizzando cellule dissociate. Ad esempio, il sequenziamento dell’RNA a singola cella è un metodo potente e ad alta produttività per la profilazione trascrittamica nelle singole cellule, progettato per comprendere il trascrittame del tessuto complesso con una risoluzione a singola cellula1,2,3,4. La coltura cellulare primaria si è dimostrata uno strumento utile per studiare la funzione e la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici per le papillegustative 5,6. Questi studi richiedono una grande quantità di popolazioni cellulari isolate di alta qualità (ad esempio, numero totale sufficiente di cellule con concentrazione adeguata e alta vitalità).
Pertanto, è necessario isolare le cellule da diverse regioni dei tessuti linguali e in diverse fasi di sviluppo. Attualmente, non esiste un protocollo dettagliato disponibile per la dissociazione cellulare dall’epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Qui, reportiamo un metodo di dissociazione cellulare ottimizzato per preparare le cellule per esperimenti che richiedono un’alta qualità di cellule vive come per il sequenziamento dell’RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Abbiamo scoperto che la selezione del tampone di digestione enzimatica, la pipettazione delicata, la selezione del mezzo di resuspensione e il tempo e la velocità di centrifugazione ottimali sono cruciali per generare queste grandi quantità di cellule di alta qualità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ad oggi, non è stato disponibile un protocollo dettagliato per la dissociazione cellulare dall’epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Questo protocollo di dissociazione cellulare corrente fornisce una procedura riproducibile per generare una sospensione a singola cella con un’elevata vitalità cellulare (>90%) dai tessuti della lingua del topo, compresi i fogli epiteliali e i tessuti mesenchima/connettivi sia allo stadio embrionale che postnatale, anche se le cellule isolate di E12,5 e t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dai National Institutes of Health, dal numero di sovvenzione R01DC012308 e dall’R21DC018089 all’HXL. Grazie a Brett Marshall (Università della Georgia, Atene, GA) ed Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) per l’assistenza tecnica e la consultazione sulla dissociazione cellulare; a Francisca Gibson Burnley (Università della Georgia, Atene, GA) per l’editing in inglese.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
Riferimenti
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