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Biochimica

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Published: March 14, 2021
doi:
10.3791/62177
, , ,
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

Summary

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Abstract

Vários membros da família de proteínas relacionadas ao oxisterol (OSBP) (ORP)/OSBP (Osh) foram recentemente encontrados para representar um novo grupo de proteínas de transferência de lipídios (LTP) em leveduras e células humanas. Eles transferem fosfaticidalserina (PS) do ânticulo endoplasmático (ER) para a membrana plasmática (PM) via ciclos de troca PS/fosfartidylinositol 4-fosfato (PI(4)P). Esse achado permite uma melhor compreensão de como o PS, que é fundamental para os processos de sinalização, é distribuído por toda a célula e a investigação da ligação entre esse processo e o metabolismo de fosforinostito (PIP). O desenvolvimento de novos protocolos baseados em fluorescência tem sido fundamental na descoberta e caracterização deste novo mecanismo celular in vitro a nível molecular. Este artigo descreve a produção e o uso de dois sensores lipídicos fluorescentes rotulados, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,para medir a capacidade de uma proteína de extrair PS ou PI(4)P e transferir esses lipídios entre membranas artificiais. Primeiro, o protocolo descreve como produzir, rotular e obter amostras de alta pureza desses dois construtos. Em segundo lugar, este artigo explica como usar esses sensores com um leitor de microplaca de fluorescência para determinar se uma proteína pode extrair PS ou PI(4)P de lipossomos, usando Osh6p como estudo de caso. Finalmente, este protocolo mostra como medir com precisão a cinética do PS/PI(4)P troca entre lipossomos de composição lipídica definida e determinar taxas de transferência lipídica por transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) usando um fluorômetro padrão.

Introduction

A distribuição precisa de lipídios entre diferentes membranas e dentro das membranas das células eucarióticas1,2 tem profundas implicações biológicas. Descriptografar como as LTPs funcionam é uma questão importante na biologia celular3,4,5,6, e abordagens in vitro são de grande valor para abordar esta questão7,8,9,10,11. Aqui, é apresentada uma estratégia in vitro,baseada em fluorescência, que tem sido fundamental para estabelecer que várias proteínas ORP/Osh afetam a troca de PS/PI(4)P entre as membranas celulares12 e, assim, constituem uma nova classe de LTPs. PS é um glicerofosfolipídio aniônico que representa 2-10% do total de lipídios de membrana em células eucarióticas13,14,16. É distribuído ao longo de um gradiente entre o PS e o PM, onde representa 5-7% e até 30% dos glicerofosfolipídios,respectivamente 17,18,19. Além disso, ps está essencialmente concentrado no folheto citosolico do PM. Esse acúmulo e a partição desigual do PS no PM são fundamentais para os processos de sinalização celular19. Devido à carga negativa das moléculas de PS, o folheto citosolico da PM é muito mais aniônico do que o folheto citosolico de outras organelas1,2,19,20. Isso permite o recrutamento, através de forças eletrostáticas, de proteínas de sinalização como o substrato C-kinase rico em mirina-de-mirina (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, o sarcoma viral de ratos kirsten (K-Ras)23, e o substrato de toxina botulínica C3 1 (Rac1)24 que contêm um trecho de aminoágenos carregados positivamente e uma cauda lipidica.

PS também é reconhecido pela proteína convencional quinase C de forma estereoselétrica através de um domínio C225. No entanto, o PS é sintetizado no ER26,indicando que deve ser exportado para a PM antes de poder desempenhar seu papel. Não se sabia como isso foi realizado19 até a constatação de que, em leveduras, Osh6p e Osh7p transferem PS do PS do PS para a PM27. Estes LTPs pertencem a uma família evolutivamente conservada em eucariotes cujo membro fundador é OSBP e que contém proteínas (ORPs em humanos, proteínas Osh na levedura) integrando um domínio relacionado à OSBP (ORD) com um bolso para hospedar uma molécula lipídica. Osh6p e Osh7p consistem apenas em um ORD cujas características estruturais são adaptadas para ligar especificamente PS e transferi-lo entre membranas. No entanto, não ficou claro como essas proteínas transferiam o PS do PS para o PS. Osh6p e Osh7p podem prender PI(4)P como um ligante lipídemo alternativo12. Na levedura, PI(4)P é sintetizado a partir de fosfaticdylinositol (PI) no Golgi e pm por PI 4-kinases, Pik1p e Stt4p, respectivamente. Em contraste, não há PI(4)P na membrana ER, pois este lipídio é hidrolisado para PI pela fosfattase Sac1p. Assim, existe um gradiente PI(4)P nas interfaces ER/Golgi e ER/PM. Osh6p e Osh7p transferem PS do PS para o PM via ciclos de troca PS/PI(4)P utilizando o gradiente PI(4)P que existe entre essas duas membranas12.

Dentro de um ciclo, Osh6p extrai PS do ER, troca PS por PI(4)P na PM e transfere PI(4)P de volta para o PS para extrair outra molécula de PS. Osh6p/Osh7p interagem com Ist2p28, uma das poucas proteínas que conectam e trazem a membrana ER e o PM em proximidade entre si para criar locais de contato ER-PM na levedura29,30,31. Além disso, a associação de Osh6p com membranas negativamente carregadas torna-se fraca assim que a proteína extrai um de seus ligantes lipídicos devido a uma mudança conformacional que modifica suas características eletrostáticas32. Isso ajuda a Osh6p encurtando seu tempo de vida na membrana, mantendo assim a eficiência de sua atividade de transferência lipídica. Combinado com a vinculação ao Ist2p, este mecanismo poderia permitir que os Osh6p/7p executasse de forma rápida e precisa a troca lipídica na interface ER/PM. Nas células humanas, as proteínas ORP5 e ORP8 executam a troca de PS/PI(4)P nos locais de contato do ER-PM através de mecanismos distintos33. Eles possuem um ORD central, semelhante a Osh6p, mas são diretamente ancorados ao P através de um terminal C transmembrano segmento33 e atracam na PM através de um domínio de Pleckstrinia N-terminal (PH) que reconhece PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. Orp5/8 use pi(4)P para transferir PS, e foi demonstrado que orp5/8 regula adicionalmente os níveis PM PI(4,5)P2 e, presumivelmente, modulando vias de sinalização. Por sua vez, a diminuição dos níveis PI(4)P e PI(4,5)P2 reduz a atividade ORP5/ORP8, uma vez que essas proteínas associam-se ao PM de forma dependente de PIP. Síntese de PS anormalmente alta, que leva à síndrome de Lenz-Majewski, impacta os níveis de PI(4)P através de ORP5/836. Quando a atividade de ambas as proteínas é bloqueada, o PS torna-se menos abundante na PM, diminuindo a capacidade oncogênica de sinalização de proteínas37.

Por outro lado, a superexpressão orp5 parece promover a invasão de células cancerosas e processos metastáticos38. Assim, alterações na atividade ORP5/8 podem modificar severamente o comportamento celular através de alterações na homeostase lipídica. Além disso, ORP5 e ORP8 ocupam locais de contato ER-mitocôndrias e preservam algumas funções mitocondriais, possivelmente fornecendo PS39. Além disso, o ORP5 localiza os locais de contato com gotículas ER-lipídidas para fornecer PS a gotículas lipídicas por PS/PI(4)P troca40. A estratégia aqui descrita para medir (i) PS e PI(4)P extração de lipossomos e (ii) PS e PI(4)P transporte entre lipossomos foi concebida para estabelecer e analisar o PS/PI(4)P atividade de troca de Osh6p/Osh7p12,32 e usado por outros grupos para analisar a atividade de ORP5/ORP835 e outras LTPs10, 41. Baseia-se no uso de um leitor de placas de fluorescência, um espectrofluorômetro padrão em formato L e dois sensores fluorescentes, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,que podem detectar PS e PI(4)P, respectivamente.

O NBD-C2Lact corresponde ao domínio C2 da glicoproteína, lactadherina, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a solventes única perto do suposto local de ligação PS; um NBD sensível à polaridade (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluoróforo está covalentemente ligado a este resíduo(Figura 1A)12. Para ser mais preciso, o domínio C2 de lactadherina (Bos taurus, UniProt: Q95114,resíduos 270-427) foi clonado em um vetor pGEX-4T3 para ser expresso em fusão com glutathione S-transferase (GST) em Escherichia coli. coli . A sequência de C2Lact foi então mutada para substituir dois resíduos de cisteína acessíveis a solventes (C270, C427) com resíduos de alanina e para introduzir um resíduo de cisteína em uma região próxima ao local putativo de ligação PS (mutação H352C) que pode ser posteriormente rotulado com N,N’-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) diamina de etileno (IANBD) 12. Um local de decote para trombina está presente entre a proteína GST e o N-terminus do domínio C2. Uma grande vantagem é que este domínio reconhece seletivamente o PS de forma independente de Ca2+contrária a outros domínios C2 conhecidos ou anexo a A542. OFAPP NBD-PH é derivado do domínio PH da proteína 1 (FAPP1) humana de quatro fosfatos, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a um único solvente que pode ser rotulada com um grupo NBD próximo ao local de ligação PI(4)P(Figura 1A)43. A sequência nucleotídea do domínio PH da proteína FAPP humana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) foi clonada em um vetor pGEX-4T3 para ser expressa em conjunto com uma tag GST. A sequênciaPH FAPP foi modificada para inserir um resíduo único de cisteína dentro da interface de ligação de membrana da proteína43. Além disso, um linker de nove resíduos foi introduzido entre o local de decote trombina e o n-terminus do domínio PH para garantir a acessibilidade à protease.

Para medir a extração de PS de lipossomos, NBD-C2Lact é misturado com lipossomos feitos de fosfattidylcholina (PC) contendo traços de PS. Devido à sua afinidade com ps, esta construção se liga aos lipossomos, e o fluorophore NBD experimenta uma mudança na polaridade à medida que entra em contato com o ambiente hidrofóbico da membrana, que provoca uma mudança azul e um aumento da fluorescência. Se o PS for extraído quase completamente por uma quantidade estequiométrica de LTP, a sonda não se associa a lipossomos, e o sinal NBD é menor(Figura 1B)32. Essa diferença de sinal é usada para determinar se um LTP(por exemplo, Osh6p) extrai PS. Uma estratégia semelhante é usada com oFAPP NBD-PH para medir a extração PI(4)P (Figura 1B),conforme descrito anteriormente12,32. Dois ensaios baseados em FRET foram projetados para (i) medir o transporte de PS de lipossomos LA a LB, que imitam a membrana ER e a PM, respectivamente, e (ii) pi(4)P transporte na direção inversa. Estes ensaios são realizados sob as mesmas condições (ou seja, mesmo buffer, temperatura e concentração lipídica) para medir a troca de PS/PI(4)P. Para medir o transporte de PS, o NBD-C2Lact é misturado com lipossomos LA compostos por PC e dopados com 5 PS mol% e 2% de uma fosfatidetanolamina fluorescente rotulada por rhodamina (Rhod-PE)-e lipossomos LB incorporando 5 mol% PI(4)P.

No tempo zero, FRET com Rhod-PE sacia a fluorescência NBD. Se o PS for transportado de lipossomos LA para LB (por exemplo, ao injetar Osh6p), um descosmamento rápido ocorre devido à translocação de moléculas deLact NBD-C2 de lipossomos LA para LB (Figura 1C). Dada a quantidade de PS acessível, o NBD-C2Lact permanece essencialmente em um estado ligado à membrana ao longo do experimento12. Assim, a intensidade do sinal NBD se correlaciona diretamente com a distribuição de NBD-C2Lact entre lipossomos LA e LB e pode ser facilmente normalizada para determinar quanto PS é transferido. Para medir a transferência de PI(4)P na direção oposta, oFAPP NBD-PH é misturado com lipossomos LA e LB; dado que ele se liga apenas a lipossomos LB que contêm PI(4)P, mas não Rhod-PE, sua fluorescência é alta. Se pi(4)P for transferido para lipossomos LA, ele se transloca para esses lipossomos, e o sinal diminui devido ao FRET com Rhod-PE(Figura 1C). O sinal é normalizado para determinar quanto PI(4)P é transferido43.

Protocol

1. Purificação de NBD-C2Lact NOTA: Embora este protocolo detalhe o uso de um disruptor celular para quebrar bactérias, ele pode ser modificado para usar outras estratégias de lise(por exemplo, uma prensa francesa). No início da purificação, é obrigatório o uso de tampão recém-desgaseado, filtrado e suplementado com dithiothiothreitol de 2 mM (DTT) para evitar a oxidação da cisteína. No entanto, para a etapa de rotulagem de proteínas, é crucial remover completa…

Representative Results

Figura 1: Descrição dos sensores lipídicos fluorescentes e ensaios in vitro. (A) Modelos tridimensionais de NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP baseados na estrutura cristalina do domínio C2 da lactadherina bovina (PDB ID: 3BN648) e a estrutura NMR do domínio PH da proteína FAPP1 humana (PDB I…

Discussion

Os resultados desses ensaios dependem diretamente dos sinais dos sensores lipídes fluorescentes. Assim, a purificação dessas sondas rotuladas em uma proporção de 1:1 com NBD e sem contaminação livre de fluoróforos NBD é um passo crítico neste protocolo. Também é obrigatório verificar se a LTP em análise está devidamente dobrada e não agregada. A quantidade de LTP testada nos ensaios de extração deve ser igual ou superior à das moléculas acessíveis de PS ou PI(4)P para medir adequadamente se este LTP …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos ao Dr. A. Cuttriss por sua cuidadosa revisão do manuscrito. Este trabalho é financiado pela Agência Nacional de Pesquisa francesa exCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e pelo CNRS.

Materials

 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare
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Riferimenti

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochimica. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D’Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

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Ikhlef, S., Lipp, N., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).
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