Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.
Vários membros da família de proteínas relacionadas ao oxisterol (OSBP) (ORP)/OSBP (Osh) foram recentemente encontrados para representar um novo grupo de proteínas de transferência de lipídios (LTP) em leveduras e células humanas. Eles transferem fosfaticidalserina (PS) do ânticulo endoplasmático (ER) para a membrana plasmática (PM) via ciclos de troca PS/fosfartidylinositol 4-fosfato (PI(4)P). Esse achado permite uma melhor compreensão de como o PS, que é fundamental para os processos de sinalização, é distribuído por toda a célula e a investigação da ligação entre esse processo e o metabolismo de fosforinostito (PIP). O desenvolvimento de novos protocolos baseados em fluorescência tem sido fundamental na descoberta e caracterização deste novo mecanismo celular in vitro a nível molecular. Este artigo descreve a produção e o uso de dois sensores lipídicos fluorescentes rotulados, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,para medir a capacidade de uma proteína de extrair PS ou PI(4)P e transferir esses lipídios entre membranas artificiais. Primeiro, o protocolo descreve como produzir, rotular e obter amostras de alta pureza desses dois construtos. Em segundo lugar, este artigo explica como usar esses sensores com um leitor de microplaca de fluorescência para determinar se uma proteína pode extrair PS ou PI(4)P de lipossomos, usando Osh6p como estudo de caso. Finalmente, este protocolo mostra como medir com precisão a cinética do PS/PI(4)P troca entre lipossomos de composição lipídica definida e determinar taxas de transferência lipídica por transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) usando um fluorômetro padrão.
A distribuição precisa de lipídios entre diferentes membranas e dentro das membranas das células eucarióticas1,2 tem profundas implicações biológicas. Descriptografar como as LTPs funcionam é uma questão importante na biologia celular3,4,5,6, e abordagens in vitro são de grande valor para abordar esta questão7,8,9,10,11. Aqui, é apresentada uma estratégia in vitro,baseada em fluorescência, que tem sido fundamental para estabelecer que várias proteínas ORP/Osh afetam a troca de PS/PI(4)P entre as membranas celulares12 e, assim, constituem uma nova classe de LTPs. PS é um glicerofosfolipídio aniônico que representa 2-10% do total de lipídios de membrana em células eucarióticas13,14,16. É distribuído ao longo de um gradiente entre o PS e o PM, onde representa 5-7% e até 30% dos glicerofosfolipídios,respectivamente 17,18,19. Além disso, ps está essencialmente concentrado no folheto citosolico do PM. Esse acúmulo e a partição desigual do PS no PM são fundamentais para os processos de sinalização celular19. Devido à carga negativa das moléculas de PS, o folheto citosolico da PM é muito mais aniônico do que o folheto citosolico de outras organelas1,2,19,20. Isso permite o recrutamento, através de forças eletrostáticas, de proteínas de sinalização como o substrato C-kinase rico em mirina-de-mirina (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, o sarcoma viral de ratos kirsten (K-Ras)23, e o substrato de toxina botulínica C3 1 (Rac1)24 que contêm um trecho de aminoágenos carregados positivamente e uma cauda lipidica.
PS também é reconhecido pela proteína convencional quinase C de forma estereoselétrica através de um domínio C225. No entanto, o PS é sintetizado no ER26,indicando que deve ser exportado para a PM antes de poder desempenhar seu papel. Não se sabia como isso foi realizado19 até a constatação de que, em leveduras, Osh6p e Osh7p transferem PS do PS do PS para a PM27. Estes LTPs pertencem a uma família evolutivamente conservada em eucariotes cujo membro fundador é OSBP e que contém proteínas (ORPs em humanos, proteínas Osh na levedura) integrando um domínio relacionado à OSBP (ORD) com um bolso para hospedar uma molécula lipídica. Osh6p e Osh7p consistem apenas em um ORD cujas características estruturais são adaptadas para ligar especificamente PS e transferi-lo entre membranas. No entanto, não ficou claro como essas proteínas transferiam o PS do PS para o PS. Osh6p e Osh7p podem prender PI(4)P como um ligante lipídemo alternativo12. Na levedura, PI(4)P é sintetizado a partir de fosfaticdylinositol (PI) no Golgi e pm por PI 4-kinases, Pik1p e Stt4p, respectivamente. Em contraste, não há PI(4)P na membrana ER, pois este lipídio é hidrolisado para PI pela fosfattase Sac1p. Assim, existe um gradiente PI(4)P nas interfaces ER/Golgi e ER/PM. Osh6p e Osh7p transferem PS do PS para o PM via ciclos de troca PS/PI(4)P utilizando o gradiente PI(4)P que existe entre essas duas membranas12.
Dentro de um ciclo, Osh6p extrai PS do ER, troca PS por PI(4)P na PM e transfere PI(4)P de volta para o PS para extrair outra molécula de PS. Osh6p/Osh7p interagem com Ist2p28, uma das poucas proteínas que conectam e trazem a membrana ER e o PM em proximidade entre si para criar locais de contato ER-PM na levedura29,30,31. Além disso, a associação de Osh6p com membranas negativamente carregadas torna-se fraca assim que a proteína extrai um de seus ligantes lipídicos devido a uma mudança conformacional que modifica suas características eletrostáticas32. Isso ajuda a Osh6p encurtando seu tempo de vida na membrana, mantendo assim a eficiência de sua atividade de transferência lipídica. Combinado com a vinculação ao Ist2p, este mecanismo poderia permitir que os Osh6p/7p executasse de forma rápida e precisa a troca lipídica na interface ER/PM. Nas células humanas, as proteínas ORP5 e ORP8 executam a troca de PS/PI(4)P nos locais de contato do ER-PM através de mecanismos distintos33. Eles possuem um ORD central, semelhante a Osh6p, mas são diretamente ancorados ao P através de um terminal C transmembrano segmento33 e atracam na PM através de um domínio de Pleckstrinia N-terminal (PH) que reconhece PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. Orp5/8 use pi(4)P para transferir PS, e foi demonstrado que orp5/8 regula adicionalmente os níveis PM PI(4,5)P2 e, presumivelmente, modulando vias de sinalização. Por sua vez, a diminuição dos níveis PI(4)P e PI(4,5)P2 reduz a atividade ORP5/ORP8, uma vez que essas proteínas associam-se ao PM de forma dependente de PIP. Síntese de PS anormalmente alta, que leva à síndrome de Lenz-Majewski, impacta os níveis de PI(4)P através de ORP5/836. Quando a atividade de ambas as proteínas é bloqueada, o PS torna-se menos abundante na PM, diminuindo a capacidade oncogênica de sinalização de proteínas37.
Por outro lado, a superexpressão orp5 parece promover a invasão de células cancerosas e processos metastáticos38. Assim, alterações na atividade ORP5/8 podem modificar severamente o comportamento celular através de alterações na homeostase lipídica. Além disso, ORP5 e ORP8 ocupam locais de contato ER-mitocôndrias e preservam algumas funções mitocondriais, possivelmente fornecendo PS39. Além disso, o ORP5 localiza os locais de contato com gotículas ER-lipídidas para fornecer PS a gotículas lipídicas por PS/PI(4)P troca40. A estratégia aqui descrita para medir (i) PS e PI(4)P extração de lipossomos e (ii) PS e PI(4)P transporte entre lipossomos foi concebida para estabelecer e analisar o PS/PI(4)P atividade de troca de Osh6p/Osh7p12,32 e usado por outros grupos para analisar a atividade de ORP5/ORP835 e outras LTPs10, 41. Baseia-se no uso de um leitor de placas de fluorescência, um espectrofluorômetro padrão em formato L e dois sensores fluorescentes, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,que podem detectar PS e PI(4)P, respectivamente.
O NBD-C2Lact corresponde ao domínio C2 da glicoproteína, lactadherina, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a solventes única perto do suposto local de ligação PS; um NBD sensível à polaridade (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluoróforo está covalentemente ligado a este resíduo(Figura 1A)12. Para ser mais preciso, o domínio C2 de lactadherina (Bos taurus, UniProt: Q95114,resíduos 270-427) foi clonado em um vetor pGEX-4T3 para ser expresso em fusão com glutathione S-transferase (GST) em Escherichia coli. coli . A sequência de C2Lact foi então mutada para substituir dois resíduos de cisteína acessíveis a solventes (C270, C427) com resíduos de alanina e para introduzir um resíduo de cisteína em uma região próxima ao local putativo de ligação PS (mutação H352C) que pode ser posteriormente rotulado com N,N’-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) diamina de etileno (IANBD) 12. Um local de decote para trombina está presente entre a proteína GST e o N-terminus do domínio C2. Uma grande vantagem é que este domínio reconhece seletivamente o PS de forma independente de Ca2+contrária a outros domínios C2 conhecidos ou anexo a A542. OFAPP NBD-PH é derivado do domínio PH da proteína 1 (FAPP1) humana de quatro fosfatos, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a um único solvente que pode ser rotulada com um grupo NBD próximo ao local de ligação PI(4)P(Figura 1A)43. A sequência nucleotídea do domínio PH da proteína FAPP humana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) foi clonada em um vetor pGEX-4T3 para ser expressa em conjunto com uma tag GST. A sequênciaPH FAPP foi modificada para inserir um resíduo único de cisteína dentro da interface de ligação de membrana da proteína43. Além disso, um linker de nove resíduos foi introduzido entre o local de decote trombina e o n-terminus do domínio PH para garantir a acessibilidade à protease.
Para medir a extração de PS de lipossomos, NBD-C2Lact é misturado com lipossomos feitos de fosfattidylcholina (PC) contendo traços de PS. Devido à sua afinidade com ps, esta construção se liga aos lipossomos, e o fluorophore NBD experimenta uma mudança na polaridade à medida que entra em contato com o ambiente hidrofóbico da membrana, que provoca uma mudança azul e um aumento da fluorescência. Se o PS for extraído quase completamente por uma quantidade estequiométrica de LTP, a sonda não se associa a lipossomos, e o sinal NBD é menor(Figura 1B)32. Essa diferença de sinal é usada para determinar se um LTP(por exemplo, Osh6p) extrai PS. Uma estratégia semelhante é usada com oFAPP NBD-PH para medir a extração PI(4)P (Figura 1B),conforme descrito anteriormente12,32. Dois ensaios baseados em FRET foram projetados para (i) medir o transporte de PS de lipossomos LA a LB, que imitam a membrana ER e a PM, respectivamente, e (ii) pi(4)P transporte na direção inversa. Estes ensaios são realizados sob as mesmas condições (ou seja, mesmo buffer, temperatura e concentração lipídica) para medir a troca de PS/PI(4)P. Para medir o transporte de PS, o NBD-C2Lact é misturado com lipossomos LA compostos por PC e dopados com 5 PS mol% e 2% de uma fosfatidetanolamina fluorescente rotulada por rhodamina (Rhod-PE)-e lipossomos LB incorporando 5 mol% PI(4)P.
No tempo zero, FRET com Rhod-PE sacia a fluorescência NBD. Se o PS for transportado de lipossomos LA para LB (por exemplo, ao injetar Osh6p), um descosmamento rápido ocorre devido à translocação de moléculas deLact NBD-C2 de lipossomos LA para LB (Figura 1C). Dada a quantidade de PS acessível, o NBD-C2Lact permanece essencialmente em um estado ligado à membrana ao longo do experimento12. Assim, a intensidade do sinal NBD se correlaciona diretamente com a distribuição de NBD-C2Lact entre lipossomos LA e LB e pode ser facilmente normalizada para determinar quanto PS é transferido. Para medir a transferência de PI(4)P na direção oposta, oFAPP NBD-PH é misturado com lipossomos LA e LB; dado que ele se liga apenas a lipossomos LB que contêm PI(4)P, mas não Rhod-PE, sua fluorescência é alta. Se pi(4)P for transferido para lipossomos LA, ele se transloca para esses lipossomos, e o sinal diminui devido ao FRET com Rhod-PE(Figura 1C). O sinal é normalizado para determinar quanto PI(4)P é transferido43.
Os resultados desses ensaios dependem diretamente dos sinais dos sensores lipídes fluorescentes. Assim, a purificação dessas sondas rotuladas em uma proporção de 1:1 com NBD e sem contaminação livre de fluoróforos NBD é um passo crítico neste protocolo. Também é obrigatório verificar se a LTP em análise está devidamente dobrada e não agregada. A quantidade de LTP testada nos ensaios de extração deve ser igual ou superior à das moléculas acessíveis de PS ou PI(4)P para medir adequadamente se este LTP …
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos ao Dr. A. Cuttriss por sua cuidadosa revisão do manuscrito. Este trabalho é financiado pela Agência Nacional de Pesquisa francesa exCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e pelo CNRS.
L-cysteine ≥97 % (FG) | Sigma | W326305-100G | Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C |
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 | Wheaton | W224681 | |
4 mm-diameter glass beads | Sigma | Z265934-1EA | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | ||
ÄKTA purifier | GE healthcare | FPLC | |
Aluminium foil | |||
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa | Merck | UFC900324, UFC901024 | |
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa | Merck | UFC800324, UFC801024 | |
Ampicillin | Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C. | ||
Bestatin | Sigma | B8385-10mg | |
BL21 Gold Competent Cells | Agilent | ||
C16:0 Liss (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) | Avanti Polar Lipids | 810158C-5MG | |
C16:0/C16:0-PI(4)P | Echelon Lipids | P-4016-3 | Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear. |
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) | Avanti Polar Lipids | 840034C-25mg | |
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) | Avanti Polar Lipids | 850375C-500mg | |
CaCl2 | Sigma | Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water. | |
Cell Disruptor | Constant Dynamics | ||
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO | Carlo Erba | 438601 | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
Deionized (Milli-Q) water | |||
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure | |||
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder | Roche | 10104159001 | |
DTT | Euromedex | EU0006-B | Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. |
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). | Biorad | 7321010 | |
Electroporation cuvette 2 mm | Ozyme | EP102 | |
Electroporator Eppendorf 2510 | Eppendorf | ||
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes | Beckman | Spinning the batcerial lysates | |
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment | Hamilton | ||
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions | Hamilton | 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN | |
Glutathione Sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-05 | |
Glycerol (99% pure) | Sigma | G5516-500ML | |
Hemolysis tubes with a cap | |||
HEPES , >99 % pure | Sigma | H3375-500G | |
Illustra NAP 10 desalting column | GE healthcare | GE17-0854-02 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Euromedex | EU0008-B | Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. |
K-Acetate | Prolabo | 26664.293 | |
Lennox LB Broth medium without glucose | Prepared with milli-Q water and autoclaved. | ||
Liquid nitrogen | Linde | ||
Methanol (MeOH) ≥99.8% | VWR | 20847.24 | |
MgCl2 | Sigma | Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. | |
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding | Greiner Bio-one | 655900 | |
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
Monochromator-based fluorescence plate reader | TECAN | M1000 Pro | |
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) | Molecular Probes | Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark. | |
NaCl | Sigma | S3014-1KG | |
PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C. | ||
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) | Duran Group | ||
Pepstatin | Sigma | p5318-25mg | |
pGEX-C2LACT plasmid | Available on request from our lab | ||
pGEX-PHFAPP plasmid | Available on request from our lab | ||
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) | Sigma | P7626-25g | Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol |
Phosphoramidon | Sigma | R7385-10mg | |
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) | Biorad | 7311550 | |
Prefilters (10 mm in diameter). | Avanti Polar Lipids | 610014 | |
PyMOL | http://pymol.org/ | Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A) | |
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) | Hellma | ||
Quartz cuvettes | Hellma | ||
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5427R | Eppendorf | ||
Rotary evaporator | Buchi | B-100 | |
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) | Sarsted | ||
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm) | |||
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) | Eppendorf | ||
SYPRO orange | fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel | ||
Thermomixer | Starlab | ||
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA | Sigma | 10602400001 | Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C. |
Tris, ultra pure | MP | 819623 | |
Ultracentrifuge L90K | Beckman | ||
UV/Visible absorbance spectrophotometer | SAFAS | ||
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device | Jasco or Shimadzu | Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC | |
Vacuum chamber | |||
Water bath | Julabo | ||
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR | GE healthcare |