JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

Published: February 04, 2021
doi:
10.3791/62180
, , , ,
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.

Abstract

بروتينات الميسين ربط والتفاعل مع أكتين خيوط (F-أكتين) وتوجد في الكائنات الحية عبر شجرة phylogenetic. يتم تكييف بنيتها وخصائصها الأنزيمية للوظيفة الخاصة التي تنفذها في الخلايا. Myosin 5a يمشي بشكل عملي على F-actin لنقل الميلانوسومات والحويصلات في الخلايا. وعلى العكس من ذلك، يعمل الميوسين غير العضلي 2b كخيوط ثنائية القطب تحتوي على ما يقرب من 30 جزيء. يتحرك F-actin من القطبية المعاكس نحو وسط خيوط، حيث جزيئات الميوسين تعمل بشكل غير متزامن لربط أكتين، ونقل السكتة الدماغية السلطة، وتفكك قبل تكرار الدورة. غير عضلة ميوزين 2B، جنبا إلى جنب مع غيرها من الميوزين 2 isoforms غير عضلة، والأدوار التي تشمل الالتصاق الخلية، السيتوكينيس، وصيانة التوتر. يمكن دراسة قياس الميوسينيز عن طريق إجراء فحوصات الحركة المختبرية باستخدام البروتينات المنقى. في مقايسة خيوط أكتين المزلقة ، ترتبط الميوسين بسطح غطاء المجهر وتناسل الفلورسنت المسمى F-actin ، والذي يمكن تتبعه. في جزيء واحد / فرقة المقايسة الحركة، ومع ذلك، لا بد F-actin إلى coverlip ويلاحظ حركة جزيئات الميوسين المسمى الفلورسنت على F-actin. في هذا التقرير، يتم تحديد تنقية الميوسين المؤتلف 5a من خلايا Sf9 باستخدام الكروماتوغرافيا التقاربية. بعد ذلك ، نحدد اثنين من المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري: المقايسة خيوط actin المزلقة ونقس الحركة المقلوب. من هذه المقايسات، يمكن استخراج معلمات مثل سرعات نقل أكتين وأطوال وسرعات تشغيل جزيء واحد باستخدام برنامج تحليل الصور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنيات لدراسة حركة خيوط واحدة من الميوزين غير العضلي 2 isoforms، التي نوقشت هنا في سياق 2B ميوسين غير عضلي. يمثل سير العمل هذا بروتوكولا ومجموعة من الأدوات الكمية التي يمكن استخدامها لدراسة جزيء واحد وديناميكيات الفرقة من الميوسين غير العضلي.

Introduction

الميوسين هي البروتينات الحركية التي تمارس القوة على خيوط أكتين باستخدام الطاقة المستمدة من التحلل المائي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. Myosins تحتوي على الرأس والرقبة ، والذيل المجال. يحتوي مجال الرأس على منطقة ربط أكتين بالإضافة إلى موقع ربط ATP والتحلل المائي. وتتكون مجالات الرقبة من الزخارف IQ، والتي ترتبط سلاسل الضوء، كالمودولين، أو كالمودولين مثل البروتينات2،3. منطقة الذيل لديها العديد من الوظائف المحددة لكل فئة من الميوسين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر إلى تضاؤل سلسلتين ثقيلتين، وربط جزيئات البضائع، وتنظيم الميوسين عن طريق التفاعلات الأوتينهيبيتورية مع نطاقات الرأس1.

خصائص متحركة من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا بين الطبقات. وتشمل بعض هذه الخصائص نسبة الواجب (جزء من دورة myosin الميكانيكية التي لا بد أن المايوسين actin) و processivity (قدرة المحرك على اتخاذ خطوات متعددة على مسارها قبل مفرزة)4. تم تحديد أكثر من 40 فئة من الميوسين على أساس تحليلات التسلسل5،6،7،8. تصنف المايوسينات من الفئة 2 على أنها “تقليدية” لأنها كانت أول من درس. جميع الطبقات الأخرى من الميوسين، لذلك، تصنف على أنها “غير تقليدية”.

Myosin 5a (M5a) هو فئة 5 myosin وهو محرك معالجي ، مما يعني أنه يمكن أن يتخذ خطوات متعددة على طول actin قبل الانفصال. لديها نسبة واجب عالية، مما يدل على أنها تنفق جزءا كبيرا من دورتها الميكانيكية ملزمة actin9،10،11،12،13،14. على غرار الميوسينات الأخرى ، تحتوي السلسلة الثقيلة على مجال محرك N-terminal يتضمن كلا من ربط actin وموقع التحلل المائي ATP متبوعا بمنطقة الرقبة التي تعمل كذراع ذراع ، مع ستة زخارف IQ ترتبط بالسلاسل الخفيفة الأساسية (ELC) والكالمودولين (CaM)15. تحتوي منطقة الذيل على α-helical ملفوف-لفائف، والتي تغمغم جزيء، تليها منطقة ذيل كروي للشحن ملزمة. حركيته تعكس مشاركتها في نقل الميلانوسومات في الخلايا الصباغية و الشبكية endoplasmic في الخلايا العصبية Purkinje16,17. ويعتبر M5A نقل البضائع النموذجية المحرك18.

فئة 2 myosins، أو الميوسين التقليدية، وتشمل الميوسين أن تقلص الطاقة من الهيكل العظمي، والقلب، والعضلات الملساء بالإضافة إلى الميوزين غير العضلي 2 (NM2) isoforms، NM2a، 2B، و 2C19. وNM2 isoforms موجودة في السيتوبلازم لجميع الخلايا ولها أدوار مشتركة في السيتوكينيس، التصاق، مورفوجينيسيس الأنسجة، وهجرة الخلايا19،20،21،22. تناقش هذه الورقة بروتوكولات الميوسين التقليدية في سياق الميوزين غير العضلي 2b (NM2b)23. NM2b، بالمقارنة مع M5a، لديها نسبة واجب منخفض وأبطأ أنزيميا معماكس V من 0.2 ق-123 مقارنة ماكسV M5a من ≈18 ق-124. وتجدر الإشارة إلى أن بنيات NM2b المبتورة برأسين لا تتحرك بسهولة بشكل عملي على actin؛ بدلا من ذلك، كل لقاء مع actin النتائج في السكتة الدماغية السلطة تليها فصافر من جزيء25.

NM2b يحتوي على سلسلتين ثقيلتين myosin، كل مع مجال الرأس كروي واحد، واحد رافعة الذراع (مع ELC واحد وسلسلة ضوء تنظيمية واحدة (RLC)،)، وقضيب ملفوف α-helical-لفائف / المجال الذيل، ما يقرب من 1100 الأحماض الأمينية طويلة، أن يقلل من هذه السلسلتين الثقيلة. وينظم النشاط الأنزيمي والدولة الهيكلية من NM2b عن طريق الفوسفور من RLC23. NM2b unphosphorylated، في وجود ATP والقوة الأيونية الفسيولوجية (ما يقرب من 150 mM الملح)، ويعتمد تشكيل المدمجة حيث جعل الرأسين المشاركة في التفاعل غير المتماثل والذيل طيات مرة أخرى فوق رؤوس في مكانين23. في هذه الحالة، لا يتفاعل الميوسين بقوة مع أكتين ولديه نشاط أنزيمي منخفض جدا. على الفوسفور RLC بواسطة كيناز سلسلة ضوء الميوسين المعتمدة على كالمودولين (MLCK) أو كيناز البروتين المرتبط برو ، يمتد الجزيء ويرتبط مع الميوسينات الأخرى عبر منطقة الذيل لتشكيل خيوط ثنائية القطب من حوالي 30 جزيء ميوزين23. الفوسفور المذكورة أعلاه من RLC يؤدي أيضا إلى زيادة النشاط ATPase أكتين تنشيط NM2b من قبل ما يقرب من أربع مرات26،27،28. هذا الترتيب خيوط ثنائي القطب, يضم العديد من المحركات الميوسين في كل نهاية, هو الأمثل لأدوار في انكماش وصيانة التوتر, حيث يمكن نقل خيوط أكتين مع القطبية معارضة بالنسبة لبعضها البعض23,29. وبناء على ذلك، وقد ثبت NM2b لتكون بمثابة مجموعة من المحركات عند التفاعل مع أكتين. العدد الكبير من المحركات داخل هذه خيوط تسمح خيوط NM2b للتحرك بشكل عملي على خيوط أكتين، مما يجعل في عملية خيوط المختبر ممكن لتوصيف29.

في حين تم إحراز تقدم في فهم دور الميوسين في الخلية، هناك حاجة لفهم خصائصها الفردية على مستوى البروتين. لفهم تفاعلات أكتوميوسين على مستوى تفاعل بسيط بين البروتين والبروتين ، بدلا من داخل الخلية ، يمكننا التعبير عن وتنقية الميوسين المؤتلف للاستخدام في الدراسات المختبرية. نتائج مثل هذه الدراسات ثم إبلاغ علماء الأحياء الميكانيكية حول الخصائص الفيزيائية الحيوية من الميوسين محددة التي تدفع في نهاية المطاف العمليات الخلوية المعقدة12،13،14،25،29. عادة، يتم إنجاز ذلك عن طريق إضافة علامة تقارب إلى بناء myosin كامل الطول أو مبتورة وتنقية عبر الكروماتوغرافيا تقارب29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندسة البناء ليشمل الفلوروفور القابل للتكويد وراثيا أو علامة لوضع العلامات على البروتين مع الفلوروفور الاصطناعي. عن طريق إضافة مثل هذه التسمية الفلورسنت، يمكن إجراء دراسات التصوير جزيء واحد لمراقبة ميكانيكا اليوسين والحركية.

بعد تنقية, يمكن أن تتميز الميسين في عدة طرق. ويمكن قياس النشاط ATPase من خلال أساليب colorimetric، وتوفير نظرة ثاقبة استهلاك الطاقة الشاملة وتقارب أكتين من المحرك تحت ظروف مختلفة32. لمعرفة المزيد عن التماثل الميكانيكي لحركيته ، هناك حاجة إلى مزيد من التجارب. تفصل هذه الورقة طريقتين في المختبر تعتمدان على المجهر الفلوري ويمكن استخدامهما لتوصيف الخصائص المتحركة لبروتين الميوسين المنقى.

أول هذه الطرق هو المقايسة خيوط أكتين المزلقة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الخصائص الكمية لفرقة محركات الميوسين ، وكذلك دراسة جودة دفعة من البروتين النقي33. على الرغم من أن هذه الورقة تناقش استخدام المجهر الكلي الانعكاس الداخلي (TIRF) لهذا المقايسة، يمكن إجراء هذه التجارب بشكل فعال باستخدام مجهر مضان واسع المجال مجهز بكاميرا رقمية، توجد عادة في العديد من المختبرات34. في هذا المقايسة، يتم إرفاق طبقة مشبعة من محركات الميوسين إلى غطاء. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام النيتروسليلوز، والأجسام المضادة، والأغشية، SiO2-اشتقاق السطوح (مثل تريميثيلكلوروسيلين)، من بين أمور أخرى29،33،35،36،37،38. يتم تمرير خيوط أكتين المسمى Fluorescently من خلال غرفة coverslip ، التي يرتبط عليها actin إلى الميوسين المرفق بالسطح. عند إضافة ATP (وkinases في دراسة NM2) ، يتم تصوير الغرفة لمراقبة نقل خيوط الأكتين بواسطة الميوسين المرتبط بالسطح. تتبع البرمجيات يمكن استخدامها لربط سرعة وطول كل مزلق actin خيوط. يمكن أن توفر برامج التحليل أيضا مقياسا لعدد خيوط actin المتحركة والقرطاسية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد جودة إعداد الميوسين المعطى. ويمكن أيضا أن تكون نسبة خيوط المتوقفة عمدا تحويرها الربط السطحي من أكتين إلى البروتينات الأخرى وقياسها لتحديد الاعتماد على تحميل من39الميوسين . لأن كل خيوط أكتين يمكن أن تدفعها عدد كبير من المحركات المتاحة، وهذا المقايسة قابلة للاستنساخ جدا، مع السرعة النهائية المقاسة يجري قوية للاضطرابات مثل التعديلات في تركيز الميوسين بدءا أو وجود عوامل إضافية في الحل. وهذا يعني أنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة نشاط الميوسين في ظل ظروف مختلفة، مثل الفوسفور المتغيرة، ودرجة الحرارة، والقوة الأيونية، و لزوجة الحل، وآثار الحمل الناجم عن الحبال السطحية. على الرغم من أن عوامل مثل الميسين قوية الربط “رؤساء القتلى” غير قادر على التحلل المائي ATP يمكن أن يسبب خيوط أكتين المتوقفة، توجد أساليب متعددة للتخفيف من هذه القضايا والسماح لقياسات دقيقة. خصائص الحركية من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا عبر الطبقات، واعتمادا على الميسين محددة المستخدمة، وسرعة مزلق خيوط أكتين في هذا المقايسة يمكن أن تختلف من أقل من 20 نانومتر / ثانية (myosin 9)40،41،وحتى 60،000 نانومتر / ثانية (Characean myosin 11)42.

المقايسة الثانية عكس هندسة مزلق actin خيوط المقايسة12. هنا ، يتم إرفاق خيوط الأكتين بسطح الغطاء ويتم تصور حركة جزيئات واحدة من M5a أو خيوط ثنائية القطب فردية من NM2b. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد أطوال وسرعات تشغيل جزيئات الميوسين المفردة أو خيوطها على actin. غطاء مغطى بمجمع كيميائي يمنع الربط غير المحدد ويميز السطح في نفس الوقت، مثل البيوتين البولي إيثيلين غليكول (البيوتين-PEG). إضافة مشتقات avidin المعدلة ثم يعبي السطح ويتم تمرير أكتين البيوتينات من خلال الغرفة، مما أدى إلى طبقة من F-actin ملزمة بشكل ثابت إلى أسفل الغرفة. وأخيرا، يتم تدفق الميوسين المنشط والمسمي بالفلورسنت (عادة 1-100 nM) من خلال الغرفة، والتي يتم تصويرها بعد ذلك لمراقبة حركة الميوسين فوق خيوط الأكتين الثابتة.

تمثل هذه الطرائق أساليب سريعة وقابلة للاستنساخ يمكن استخدامها لدراسة ديناميكيات كل من الميوسين غير العضلي والعضلات. يحدد هذا التقرير الإجراءات لتنقية وتوصيف كل من M5a و NM2b ، مما يمثل الميوسين غير التقليدي والتقليدي ، على التوالي. ويلي ذلك مناقشة لبعض التعديلات الخاصة بالميسين، والتي يمكن إجراؤها لتحقيق التقاط الحركة بنجاح في نوعي المقايسة.

التعبير والبيولوجيا الجزيئية
يجب استنساخ cDNA لmيوزين من الفائدة على ناقلات pFastBac1 المعدلة التي ترميز إما لC-محطة FLAG-tag (DYKDDDDK) إذا كان التعبير عن M5a-HMM, أو علامة FLAG N-المحطة إذا أعرب عن جزيء كامل الطول من NM2b23,43,44,45,46. C-محطة FLAG-العلامات على NM2b النتائج في تقارب ضعف البروتين للعمود العلم تقارب. في المقابل، البروتين N-terminally FLAG الموسومة عادة يربط جيدا إلى العمود العلم تقارب23. يحتفظ البروتين الموسوم بشكل نهائي بالنشاط الأنزيمي والنشاط الميكانيكي والتنظيم المعتمد على الفوسفور23.

في هذه الورقة، تم استخدام ماوس مبتور M5a meromyosin الثقيلة (HMM) مثل بناء مع GFP بين العلامة FLAG وC-terminus من سلسلة الميوزين الثقيلة. لاحظ أنه على عكس NM2b، يمكن وضع علامة على M5a-HMM بنجاح وتنقيته باستخدام علامات FLAG N-أو C-terminal وفي كلتا الحالتين سيكون البناء الناتج نشطا. تم اقتطاع سلسلة M5a الثقيلة في الأحماض الأمينية 1090 ويحتوي على ثلاثة وصلة الأحماض الأمينية (GCG) بين GFP ومنطقة ملفوف لفائف من M5a47. لم يتم إضافة رابط إضافي بين GFP و FLAG-tag. M5a-HMM شارك في التعبير مع كالمودولين. وقد شارك في التعبير عن بناء NM2b البشري الكامل الطول مع ELC و RLC. تم دمج N-termini من RLC مع GFP عبر رابط من خمسة أحماض أمينية (SGLRS). تعلق مباشرة إلى العلامة FLAG كان HaloTag. بين هالوتاغ والنهاء ن من سلسلة الميسين الثقيلة كان رابط مصنوع من اثنين من الأحماض الأمينية (AS).

تم تنقية كل من الاستعدادات الميوسين من لتر واحد من ثقافة الخلية Sf9 المصابة بفيروس baculo في كثافة حوالي 2 × 106 خلايا / مل. تعتمد أحجام الفيروس الكولو لكل وحدة فرعية على تعدد عدوى الفيروس كما تحددها تعليمات الشركة المصنعة. في حالة M5a ، كانت الخلايا مصابة بفيروسين باكولو مختلفين – واحد للكالمودولين ، وواحد لسلسلة M5a الثقيلة. في حالة NM2b ، كانت الخلايا مصابة بثلاثة فيروسات مختلفة – واحد ل ELC ، واحد ل RLC ، وواحد لسلسلة NM2b الثقيلة. للمختبرات التي تعمل مع مجموعة متنوعة من الميوسين (أو غيرها من البروتينات متعددة التعقيد)، وهذا النهج هو كفاءة لأنه يسمح للعديد من تركيبات من سلاسل الثقيلة والخفيفة والسلاسل الخفيفة المستخدمة عادة مثل كالمودولين يمكن أن تكون مشتركة مع العديد من سلاسل ثقيلة myosin مختلفة. تم الانتهاء من جميع أعمال الخلية في خزانة السلامة البيولوجية مع تقنية معقمة مناسبة لتجنب التلوث.

للتعبير عن كل من M5a و NM2b ، تم جمع خلايا Sf9 المنتجة للميوسين المؤتلف بعد يومين إلى 3 أيام من العدوى ، عن طريق الطرد المركزي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم الحصول على الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي خلايا SF9 المصابة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 2800 × ز. يتم تفصيل عملية تنقية البروتين أدناه.

Protocol

1. تنقية البروتين تحلل الخلايا واستخراج البروتين إعداد مخزن استخراج 1.5x استنادا إلى الجدول 1. تصفية وتخزين عند 4 °C. بدء ذوبان الكريات الخلية على الجليد. بينما الكريات هي ذوبان الجليد, تكملة 100 مل من استخراج العازلة مع 1.2 m M dithiothreitol (DTT), 5 ميكروغرام / مل ليوبيتين, 0.5 ميكروم…

Representative Results

تنقية الميوسين يمكن تقييمها عن طريق أداء الحد من الصوديوم دودسيل كبريتات-بولياكريلاميد (SDS-PAGE) هلام-electrophoresis كما هو موضح في الشكل 2. في حين أن هذا الرقم يمثل الميسين النهائي ، بعد dialyzed ، يمكن إجراء SDS-PAGE على aliquots من مختلف مراحل إجراء التطهير لتحديد أي منتجات فقدت للناموست. Myosin …

Discussion

هنا هو سير العمل لتنقية وتوصيف في المختبر من 5a ميوزين و2b غير عضلة ميوسين. هذه المجموعة من التجارب مفيدة لتحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية لبنى الميوسين المنقى بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من أن اثنين من الميوسين هو مبين هنا ليست سوى مثالين محددين من بين العديد من الاحتمال?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر الدكتور فانغ زانغ على المساعدة التقنية في إعداد الكواشف المستخدمة لجمع هذه البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI / NIH صندوق برنامج البحوث داخل الجافية HL001786 إلى J.R.S.

Materials

1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper – Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper – Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish – Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish – Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O’Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochimica. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochimica. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

MyosinIn VitroFluorescence MicroscopyMotility AssaysNon-muscle MyosinProtein DynamicsSingle MoleculeEnsembleCytoskeletal SystemsKinesinsDyneinsMicrotubulesNitrocelluloseFlow Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image