JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Published: February 04, 2021
doi:
10.3791/62180
, , , ,
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Abstract

Myosine-eiwitten binden en interageren met filamenteuze actine (F-actine) en worden aangetroffen in organismen in de fylogenetische boom. Hun structuur en enzymatische eigenschappen zijn aangepast voor de specifieke functie die ze in cellen uitvoeren. Myosine 5a loopt processief op F-actine om melanosomen en blaasjes in cellen te transporteren. Omgekeerd werkt niet-amuscle myosine 2b als een bipolair filament dat ongeveer 30 moleculen bevat. Het beweegt F-actine van tegenovergestelde polariteit naar het midden van de gloeidraad, waar de myosinemoleculen asynchroon werken om actine te binden, een krachtslag te geven en te ontkoppelen voordat de cyclus wordt herhaald. Nonmuscle myosine 2b, samen met zijn andere nonmuscle myosine 2 isovormen, heeft rollen die celadhesie, cytokinese en spanningsonderhoud omvatten. De mechanochemie van myosines kan worden bestudeerd door in vitro motiliteitstesten uit te voeren met behulp van gezuiverde eiwitten. In de gliding actine filament assay, de myosines zijn gebonden aan een microscoop coverslip oppervlak en translocate fluorescerend gelabeld F-actine, die kan worden gevolgd. In de single molecule/ensemble motility assay is F-actine echter gebonden aan een coverslip en wordt de beweging van fluorescerend gelabelde myosinemoleculen op de F-actine waargenomen. In dit rapport wordt de zuivering van recombinant myosine 5a uit Sf9-cellen met behulp van affiniteitschromatografie beschreven. Hierna schetsen we twee fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays: de gliding actine filament assay en de omgekeerde motility assay. Uit deze test kunnen parameters zoals actinetranslocatiesnelheden en looplengtes en snelheden van één molecuul worden geëxtraheerd met behulp van de beeldanalysesoftware. Deze technieken kunnen ook worden toegepast om de beweging van enkelvoudige filamenten van de niet-muscle myosine 2 isovormen te bestuderen, die hierin worden besproken in de context van niet-amuscle myosine 2b. Deze workflow vertegenwoordigt een protocol en een reeks kwantitatieve tools die kunnen worden gebruikt om de enkele molecuul- en ensembledynamiek van niet-muscle myosines te bestuderen.

Introduction

Myosines zijn motoreiwitten die kracht uitoefenen op actinefilamenten met behulp van de energie die wordt afgeleid van adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyse1. Myosines bevatten een hoofd-, nek- en staartdomein. Het hoofddomein bevat het actinebindende gebied en de site van ATP-binding en hydrolyse. De nekdomeinen zijn samengesteld uit IQ-motieven, die zich binden aan lichte ketens, calmodulin of calmodulin-achtige eiwitten2,3. Het staartgebied heeft verschillende functies die specifiek zijn voor elke klasse myosines, waaronder maar niet beperkt tot de verkleining van twee zware ketens, binding van ladingmoleculen en regulering van het myosine via auto-inhibitory interacties met de hoofddomeinen1.

De beweeglijke eigenschappen van myosine variëren sterk tussen klassen. Sommige van deze eigenschappen omvatten de duty ratio (de fractie van de mechanische cyclus van myosine waarin de myosine gebonden is aan actine) en processiviteit (het vermogen van een motor om meerdere stappen op zijn spoor te maken voordat hij wordt losgemaakt)4. De meer dan 40 klassen myosines werden bepaald op basis van sequentieanalyses5,6,7,8. De klasse 2 myosines zijn geclassificeerd als “conventioneel” omdat ze de eerste waren die werden bestudeerd; alle andere klassen myosines worden daarom geclassificeerd als “onconventioneel”.

Myosine 5a (M5a) is een klasse 5 myosine en is een processieve motor, wat betekent dat het meerdere stappen langs actine kan nemen voordat het dissocieert. Het heeft een hoge duty ratio , wat aangeeft dat het een groot deel van zijn mechanische cyclus besteedt aan actin9,10,11,12,13,14. Net als andere myosines bevat de zware ketting een N-terminal motordomein dat zowel een actinebinding als een ATP-hydrolyseplaats omvat, gevolgd door een nekgebied dat dient als hefboomarm, met zes IQ-motieven die zich binden aan essentiële lichtketens (ELC) en calmodulin (CaM)15. Het staartgebied bevat α-spiraalvormige coiled-coils, die het molecuul dimmen, gevolgd door een bolvormig staartgebied voor het binden van lading. De kinetiek weerspiegelt zijn betrokkenheid bij het transport van melanosomen in melanocyten en van het endoplasmatisch reticulum in Purkinje neuronen16,17. M5a wordt beschouwd als de prototypische vrachtvervoermotor18.

Klasse 2 myosines, of de conventionele myosines, omvatten de myosines die samentrekking van skelet, hart en gladde spieren aandrijven naast de niet-muscle myosine 2 (NM2) isovormen, NM2a, 2b en 2c19. De NM2-isovormen worden aangetroffen in het cytoplasma van alle cellen en hebben gedeelde rollen in cytokinese, adhesie, weefselmorfogenese en celmigratie19,20,21,22. Dit artikel bespreekt conventionele myosineprotocollen in de context van niet-muscle myosine 2b (NM2b)23. NM2b heeft, in vergelijking met M5a, een lage duty ratio en is enzymatisch langzamer met een Vmax van 0,2 s-123 in vergelijking met M5a’s Vmax van ≈18 s-124. Met name afgeknotte NM2b-constructies met twee koppen bewegen niet gemakkelijk procesief op actine; in plaats daarvan resulteert elke ontmoeting met actine in een machtsslag gevolgd door dissociatie van het molecuul25.

NM2b bevat twee myosine zware kettingen, elk met één bolvormig hoofddomein, één hendelarm (met één ELC en één regulerende lichte ketting (RLC)), en een α-spiraalvormige spiraalvormige staaf/staartdomein, ongeveer 1.100 aminozuren lang, dat deze twee zware kettingen verkleint. De enzymatische activiteit en de structurele toestand van NM2b worden gereguleerd door fosforylering van RLC23. Niet-gefosforyleerde NM2b, in aanwezigheid van ATP en fysiologische ionische sterktes (ongeveer 150 mM zout), keurt een compacte conformatie goed waarbij de twee koppen deelnemen aan een asymmetrische interactie en de staart op twee plaatsen terugvouwt over de koppen23. In deze toestand heeft het myosine geen sterke interactie met actine en heeft het een zeer lage enzymatische activiteit. Bij RLC-fosforylering door calmodulin-afhankelijke myosine lichtketenkinase (MLCK) of Rho-geassocieerd eiwitkinase, breidt het molecuul zich uit en associeert het met andere myosines door het staartgebied om bipolaire filamenten te vormen van ongeveer 30 myosinemoleculen23. De bovengenoemde fosforylering van de RLC leidt ook tot een verhoogde actine-geactiveerde ATPase-activiteit van NM2b met ongeveer vier keer26,27,28. Deze bipolaire filamentopstelling, met veel myosinemotoren aan elk uiteinde, is geoptimaliseerd voor rollen in contractie- en spanningsonderhoud, waarbij actinefilamenten met tegengestelde polariteiten ten opzichte van elkaar kunnen worden verplaatst23,29. Het is dan ook aangetoond dat NM2b als een ensemble van motoren fungeert bij interactie met actine. Het grote aantal motoren binnen deze gloeidraad laat NM2b-filamenten in staat om processief te bewegen op actinefilamenten, waardoor in vitro filamentprocesiviteit mogelijk is om29te karakteriseren .

Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van de rol van myosines in de cel, is er een behoefte om hun individuele kenmerken op eiwitniveau te begrijpen. Om actomyosine-interacties op een eenvoudig eiwit-eiwitinteractieniveau te begrijpen, in plaats van in een cel, kunnen we recombinante myosines uitdrukken en zuiveren voor gebruik in in vitro studies. De resultaten van dergelijke studies informeren mechanobiologen vervolgens over de biofysische eigenschappen van specifieke myosines die uiteindelijk complexe cellulaire processen aansturen12,13,14,25,29. Meestal wordt dit bereikt door een affiniteitstag toe te voegen aan een volledige of afgeknotte myosineconstructie en te zuiveren via affiniteitschromatografie29,30,31. Bovendien kan de constructie worden ontworpen om een genetisch encodable fluorofoor of een label voor eiwitetikettering met een synthetische fluorofoor op te nemen. Door zo’n fluorescerend label toe te voegen, kunnen beeldvormingsstudies met één molecuul worden uitgevoerd om myosinemechanica en kinetiek te observeren.

Na zuivering kan de myosine op verschillende manieren worden gekarakteriseerd. ATPase-activiteit kan worden gemeten met colorimetrische methoden, die inzicht geven in het totale energieverbruik en de affiniteit van de motor onder verschillende omstandigheden in werking stellen32. Om meer te weten te komen over de mechanochemie van de beweeglijkheid ervan, zijn verdere experimenten nodig. Dit artikel beschrijft twee in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de beweeglijke eigenschappen van een gezuiverd myosine-eiwit te karakteriseren.

De eerste van deze methoden is de glijdende actinegloeidraadtest, die kan worden gebruikt om de ensemble-eigenschappen van myosinemotoren kwantitatief te bestuderen, evenals de kwaliteit van een partij gezuiverd eiwit kwalitatief te bestuderen33. Hoewel dit artikel het gebruik van tirf-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) voor deze test bespreekt, kunnen deze experimenten effectief worden uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop in het breed veld die is uitgerust met een digitale camera, die vaak in veel laboratoria wordt aangetroffen34. In deze test wordt een verzadigende laag myosinemotoren bevestigd aan een coverslip. Dit kan worden bereikt met behulp van nitrocellulose, antilichamen, membranen, SiO2-gederivatiseerde oppervlakken (zoals trimethylchlorosilane), onder andere29,33,35,36,37,38. Fluorescerend gelabelde actinefilamenten worden door de afdeklipkamer gepasseerd, waarop de actine zich bindt aan de myosine die aan het oppervlak is bevestigd. Na toevoeging van ATP (en kinases in de studie van NM2) wordt de kamer afgebeeld om de translocatie van actinefilamenten door de oppervlaktegebonden myosines te observeren. Tracking software kan worden gebruikt om de snelheid en lengte van elke glijdende actine filament correleren. Analysesoftware kan ook een maat bieden voor het aantal bewegende en stationaire actinefilamenten, wat nuttig kan zijn om de kwaliteit van een bepaald myosinepreparaat te bepalen. Het aandeel vastgelopen filamenten kan ook opzettelijk worden gemoduleerd door oppervlaktegebonden actine aan andere eiwitten en gemeten om de belastingsafhankelijkheid van het myosine39te bepalen . Omdat elk actinefilament kan worden aangedreven door een groot aantal beschikbare motoren, is deze test zeer reproduceerbaar, waarbij de uiteindelijke gemeten snelheid robuust is voor verstoringen zoals veranderingen in de start myosineconcentratie of de aanwezigheid van extra factoren in de oplossing. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden aangepast om myosine-activiteit te bestuderen onder verschillende omstandigheden, zoals gewijzigde fosforylering, temperatuur, ionische sterkte, viscositeit van de oplossing en de effecten van belasting veroorzaakt door oppervlaktetethers. Hoewel factoren zoals sterk bindende myosine “dode hoofden” die niet in staat zijn tot ATP-hydrolyse vastgelopen actinefilamenten kunnen veroorzaken, bestaan er meerdere methoden om dergelijke problemen te verminderen en nauwkeurige metingen mogelijk te maken. De kinetische eigenschappen van myosine variëren sterk tussen de klassen en, afhankelijk van de specifieke myosine die wordt gebruikt, kan de snelheid van actinefilament glijden in deze test variëren van minder dan 20 nm/s (myosine 9)40,41en tot 60.000 nm/s(Characean myosine 11)42.

De tweede test keert de geometrie van de glijdende actinegloeidraadtestom 12. Hier worden de actinefilamenten aan het afdeklipoppervlak bevestigd en wordt de beweging van enkele moleculen van M5a of van individuele bipolaire filamenten van NM2b gevisualiseerd. Deze test kan worden gebruikt om de looplengtes en snelheden van enkele myosinemoleculen of filamenten op actine te kwantificeren. Een coverlip is bedekt met een chemische verbinding die niet-specifieke binding blokkeert en tegelijkertijd het oppervlak functionaliseert, zoals biotine-polyethyleenglycol (biotine-PEG). De toevoeging van gemodificeerde avidinderivaten priemt vervolgens het oppervlak en biotinylated actine wordt door de kamer gepasseerd, wat resulteert in een laag F-actine die stabiel aan de onderkant van de kamer is gebonden. Ten slotte wordt geactiveerd en fluorescerend gelabeld myosine (meestal 1-100 nM) door de kamer gestroomd, die vervolgens wordt afgebeeld om myosinebeweging over de stationaire actinefilamenten te observeren.

Deze modaliteiten vertegenwoordigen snelle en reproduceerbare methoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek van zowel niet-amuskel- als spier myosines te onderzoeken. Dit verslag schetst de procedures om zowel M5a als NM2b te zuiveren en te karakteriseren, die respectievelijk onconventionele en conventionele myosines vertegenwoordigen. Dit wordt gevolgd door een bespreking van enkele myosine-specifieke aanpassingen, die kunnen worden uitgevoerd om een succesvolle vastlegging van beweging in de twee soorten van de test te bereiken.

Expressie en moleculaire biologie
Het cDNA voor het myosine van belang moet worden gekloond op een gemodificeerde pFastBac1-vector die codeert voor een C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) als M5a-HMM wordt uitdrukt, of een N-terminal FLAG-tag als het molecuul van NM2b23,43,44,45,46wordt uitdrukt . C-terminal FLAG-tags op NM2b resulteert in een verzwakte affiniteit van het eiwit voor de KOLOM FLAG-affiniteit. Daarentegen bindt het N-terminaal MET VLAG gelabelde eiwit zich meestal goed aan de KOLOM FLAG-affiniteit23. Het N-terminaal gelabelde eiwit behoudt enzymatische activiteit, mechanische activiteit en fosforyleringsafhankelijke regulatie23.

In dit artikel werd een afgeknotte muis M5a heavy meromyosine (HMM)-achtige constructie gebruikt met een GFP tussen de FLAG-tag en het C-terminus van de myosine zware ketting. Merk op dat in tegenstelling tot NM2b M5a-HMM met succes kan worden getagd en gezuiverd met N- of C-terminal FLAG-tags en in beide gevallen zal de resulterende constructie actief zijn. De M5a zware keten werd afgekapt op aminozuur 1090 en bevat een drie aminozuur linker (GCG) tussen de GFP en het coiled-coil gebied van de M5a47. Er is geen extra linker toegevoegd tussen de GFP en FLAG-tag. M5a-HMM werd samen met calmodulin uitgedrukt. De volledige menselijke NM2b-constructie werd samen met ELC en RLC tot uitdrukking gebracht. De N-termini van de RLC werd gefuseerd met een GFP via een linker van vijf aminozuren (SGLRS). Direct gekoppeld aan de FLAG-tag was een HaloTag. Tussen de HaloTag en het N-eindpunt van de myosine zware keten was een linker gemaakt van twee aminozuren (AS).

Beide myosinepreparaten werden gezuiverd uit één liter Sf9-celkweek die besmet was met baculovirus met een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/ml. De volumes van het baculovirus voor elke subeenheid waren afhankelijk van de veelheid van infectie van het virus, zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. In het geval van M5a werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met twee verschillende baculovirussen- één voor calmodulin en één voor M5a zware keten. In het geval van de NM2b werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met drie verschillende virussen- één voor ELC, één voor RLC en één voor NM2b zware keten. Voor laboratoria die werken met een diversiteit aan myosines (of andere multicomplexe eiwitten), is deze aanpak efficiënt omdat het veel combinaties van zware en lichte ketens mogelijk maakt en veelgebruikte lichte ketens zoals calmodulin kunnen worden gecotransfecteerd met veel verschillende myosine zware ketens. Al het celwerk werd voltooid in een bioveiligheidskast met de juiste steriele techniek om besmetting te voorkomen.

Voor de expressie van zowel M5a als NM2b werden de Sf9-cellen die de recombinante myosines produceren 2-3 dagen na infectie verzameld, via centrifugeren, en opgeslagen bij -80 °C. Celkorrels werden verkregen door de met co-geïnfecteerde Sf9-cellen gedurende 30 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C te centrifugeren. Het eiwitzuiveringsproces wordt hieronder beschreven.

Protocol

1. Eiwitzuivering Cellyse en eiwitextractie Bereid een 1,5x extractiebuffer voor op basis van tabel 1. Filtreer en bewaar bij 4 °C. Begin met het ontdooien van de celkorrels op ijs. Terwijl de pellets ontdooien, vult u 100 ml extractiebuffer aan met 1,2 ml dithiothreitol (DTT), 5 μg/ml leupeptine, 0,5 μM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en twee proteaseremmertabletten. Blijf op ijs. Zodra de pellet ontdooid is, voegt u 1 ml van de aangevulde extractiebuffer to…

Representative Results

De zuivering van myosine kan worden geëvalueerd door het verminderen van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-elektroforese zoals weergegeven in figuur 2. Terwijl dit cijfer de definitieve, post-dialysed myosine vertegenwoordigt, kan SDS-PAGE op aliquots van de verschillende stadia van de zuiveringsprocedure worden uitgevoerd om om het even welke producten te identificeren die aan supernatant verloren gaan. Myosin 5a HMM heeft een band in het 120-130 kDa bereik en de full-len…

Discussion

Hier wordt een workflow gepresenteerd voor de zuivering en in vitro karakterisering van myosine 5a en niet-amuscle myosine 2b. Deze reeks experimenten is nuttig voor het kwantificeren van de mechanochemische eigenschappen van gezuiverde myosineconstructies op een snelle en reproduceerbare manier. Hoewel de twee myosines die hier worden getoond slechts twee specifieke voorbeelden zijn van de vele mogelijkheden, kunnen de voorwaarden en technieken, met enige aanpassing, worden toegepast op de meeste myosines en op vele and…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Fang Zhang voor technische hulp bij de voorbereiding van de reagentia die worden gebruikt voor het verzamelen van deze gegevens. Dit werk werd ondersteund door de NHLBI/NIH Intramuraal OnderzoekSprogramma fondsen HL001786 aan J.R.S.

Materials

1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper – Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper – Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish – Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish – Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O’Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochimica. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochimica. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

MyosinIn VitroFluorescence MicroscopyMotility AssaysNon-muscle MyosinProtein DynamicsSingle MoleculeEnsembleCytoskeletal SystemsKinesinsDyneinsMicrotubulesNitrocelluloseFlow Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image