Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Porcine Hornhin Tissue Explant at studere effekten af Herpes Simplex Virus-1 Antivirale lægemidler

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62195
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Illinois at Chicago

Summary

Vi beskriver brugen af en hornhin hornhin til at teste den antivirale effekt af eksperimentelle lægemidler.

Abstract

Vira og bakterier kan forårsage en række okulære overfladefejl og degeneration såsom sår og sår gennem hornhindeinfektion. Med en seroprevalens, der spænder fra 60-90% på verdensplan, forårsager Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) almindeligvis slimhindede læsioner i orofacialområdet, som også manifesterer sig som læsioner og infektionsrelateret blindhed. Mens de nuværende antivirale lægemidler er effektive, kræver fremkomsten af resistens og persistens af giftige bivirkninger udvikling af nye antivirale lægemidler mod dette allestedsnærværende patogen. Selv om in vitro-vurdering giver nogle funktionelle data vedrørende en spirende antiviral, de ikke påvise kompleksiteten af okulært væv in vivo. In vivo-undersøgelser er imidlertid dyre og kræver uddannet personale, især når man arbejder med virale stoffer. Derfor ex vivo modeller er effektive endnu billige trin til antivirale test. Her diskuterer vi en protokol til at studere infektion med HSV-1 ved hjælp af porcine hornhin hornhinde ex vivo og en metode til at behandle dem topisk ved hjælp af eksisterende og nye antivirale lægemidler. Vi demonstrerer også metoden til at udføre en plak assay ved hjælp af HSV-1. De beskrevne metoder kan anvendes til at udføre lignende forsøg for at studere infektioner, der ligner HSV-1 patogenet.

Introduction

Personer, der lider af øjeninfektioner, pådrager sig ofte synstab1. Med en høj seroprevalens på verdensplan lider HSV-inficerede personer af tilbagevendende øjeninfektioner, der fører til hornhinde ardannelse, stromal keratitis og neovascularization2,3,4,5. HSV-infektioner har også vist sig at forårsage sjældnere, en række alvorlige tilstande blandt immunkompromitterede, ubehandlede patienter som encephalitis og systemisk sygelighed6,7,8. Lægemidler som Acyclovir (ACV) og dens nukleoside analoger har vist konsekvent succes med at bremse HSV-1 infektion og endda kontrollere reaktivering endnu den langvarige brug af disse stoffer er forbundet med nyresvigt, føtale abnormiteter og manglende begrænsning af fremkomsten af lægemiddelresistens mod udviklende virusstammer9,10,11,12,13. Kompleksiteter forbundet med HSV-1 okulære infektioner, er tidligere blevet undersøgt in vitro ved hjælp af monolayers og 3D kulturer af menneskelige hornhindeceller og in vivo ved hjælp af murin eller kanin okulære infektioner. Mens disse in vitro-modeller giver betydelige data om de cellulære biologiske komponenter i HSV-1-infektioner, undlader de imidlertid at efterligne den indviklede kompleksitet af hornhindevæv og gør meget for at belyse dendritiske spredning af virus14. I modsætning hertil, selv om in vivo systemer er mere indsigtsfulde i at vise infektion spredes i hornhinder og immunaktivering svar under HSV-1 infektion, de kommer med det forbehold, at de kræver uddannede efterforskere og store faciliteter for dyrepleje at overse eksperimenter.

Her bruger vi porcine hornhinde som en ex vivo model til at undersøge HSV-1 infektion induceret sårsystem. Både den potentielle farmakologi af visse lægemidler samt celle- og molekylærbiologien i sårsystemet forårsaget af infektionen kan studeres gennem vævseksplanter. Denne model kan også ændres til brug for andre virale og bakterielle infektioner samt. I denne undersøgelse blev der anvendt hornhinhindeas til at teste den antivirale effekt af et præklinisk lille molekyle, BX795. Brugen af hornhin hornhinde var foretrukket på grund af nem adgang og omkostningseffektivitet. Derudover er porcine hornhin hornhin modeller gode modeller af menneskelige øjne med hornhinder er let at isolere, tilstrækkeligt størrelse til infektion og visualisering og robust til at håndtere15. Porcine hornhin hornhinde er også sammenlignelig med kompleksiteten af menneskelige hornhinde modeller i både trans hornhinde permeabilitet og systemisk absorption15. Ved at bruge denne model til undersøgelsen var vi i stand til at belyse, hvordan BX795 er værd at undersøge nærmere som en kompetent hæmmer af HSV-1-virusinfektion og tilføjer til litteraturen om at klassificere det som en potentiel lillemolekyle antiviral forbindelse16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de svin væv, der anvendes i denne undersøgelse blev leveret af en tredjepart privat organisation og ingen af de dyr håndtering blev udført af University of Illinois i Chicago personale.

1. Materialer

  1. Reagenser
    1. Brug følgende reagenser til plaque assay: pulver methylcellulose, Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), føtalt kvægserum (FBS), penicillin og streptomycin (P/S) til plaqueanalyse.
    2. Brug krystal violette tabletter og ethanol (molekylærbiologisk kvalitet) til fremstilling af krystal violet opløsning til plaque assay.
  2. Vero celle vækst medier - DMEM hele medier
    1. Åbn DMEM medieflasken inde i vævskulturens hætte. Fjern 55 mL medier fra flasken med en serologisk pipette, og kassér den. Der tilsættes 50 mL FBS af P/S til DMEM. Opbevares i køleskab ved 4 °C.
  3. Plaque assay medier - Lager af 5% methylcellulose medier
    1. Mål 2,5 g methylcellulosepulver med en omrøringsmagnet inde i en 500 mL glasflaske og autoklave den. Når flasken er afkølet til stuetemperatur, skal du tage 500 mL DMEM hele medier, der indeholder 50 mL FBS og 5 mL P /S og tilsæt den til glasflaske indeholdende methylcellulose.
    2. Rør i den ved 4 °C i 2 dage med en magnetisk omrører. Opbevares i køleskab ved 4 °C.
  4. Medieforberedelse til udskåret hornhinde hornhinde
    1. Åbn en minimum væsentlige medier (MEM) flaske inde i væv kultur hætte. Kassér 10 mL MEM fra flasken ved hjælp af en serologisk pipette.
    2. Der tilsættes 5 mL insulinoverførsels selen (ITS) og 5 mL antimykotisk antibiotika (AA) til medierne og opbevares i køleskab ved 4 °C.
  5. Master og arbejder lager af krystal violet:
    1. For at gøre krystal violet lageropløsning, tilsæt 1 g krystal violet pulver til 100 mL af 20% ethanol i vand. Denne bestand (1% w / v krystal violet) kan opbevares og bruges i op til år, når de opbevares på et sted, der er mørkt.
    2. For at gøre en arbejdsgruppe lager fra dette, tilføje 50 mL af oprindelige lager løsning til 350 mL vand. Tilsæt 100mL ethanol til denne opløsning for at lave en 500 mL fungerende krystal violet opløsning (0,1% w /v krystal violet).
      BEMÆRK: Begge disse løsninger skal opbevares i mørke.

2. Procedure

  1. Isolering af porcine hornhinder fra hele øjnene17
    1. Når du modtager porcine øjne fra en passende leverandør, opbevares på is, hvis der er en forsinkelse med vævsbehandling som afbilledet i figur 1.
    2. Sørg for, at der anvendes og bæres personligt beskyttelsesudstyr under denne procedure for at undgå forurening samt ulykker fra spild af glasagtig humor.
    3. Spray arbejdsområdet med 70% ethanol for at rengøre og desinficere. For at sikre, at arbejdsområdet er stabilt, skal du sprede et bænkdæksel og tape sikkert ned ad siderne som afbildet i figur 2.
    4. Placer porcine øjne på gaze(figur 3). Hold den bageste del (figur 4A) i porcineøjne som vist i figur 4B med den ene hånd ved hjælp af 50 mm gaze.
    5. Med en 30 G nål, forsigtigt gøre en enkelt poke på omtrent midten af epitel overflade af øjet omhyggeligt og sikre, at der ikke er nogen skade på stroma (Figur 5). Poke bør begrænses til epitel (~ 100-200 μm) for at undgå stromal involvering.
    6. Brug et skarpt steriliseret blad, lav et lille snit på scleraen i 1 mm afstand fra hornhinden. Skær kanten af hornhinden sikre, at glaslegeme humor ikke lækker ved hjælp af en hurtig og glat roterende handling af hånden (Figur 6A). Ved at holde hornhinden i hornhinden-sclera kanten med en flad pincet, afskære de resterende tøjring membraner i øjet ved hjælp af bladet (Figur 6B).
    7. Tag hornhinden og læg den i en 12-brønd plade overlejret med 2 mL hornhinde medium. Hornhinden skal placeres med billedflade med billedflade i øjnene, hvilket fremgår af en række trin i figur 7A-D, figur 8).
    8. Der tilsættes 5 μL af virusopløsningen, der indeholder 5 x 105 plakdannende enheder (PFU) på 17 GFP til det debriderede sted på hornhindeoverfladen. Anbring 12-brøndspladen, der indeholder inficerede hornhinder, i en inkubator med 5 % CO2 i 72 timer.
    9. Spray eventuelle ekstra øjne, der ikke anvendes i eksperiment med 10% blegemiddel og sikkert bortskaffes i biohazard poser.
  2. Visualisering
    BEMÆRK: Virussen skal visualiseres hver dag før tilsætning af lægemidler.
    1. Tænd stereomikroskopet og LED-lyskilden, og lad maskinens lampe varme op, før hornhinderen tages i brug. Bær forsigtigt pladen af hornhinder til instrument uden at forstyrre opløsningen. Skift filteret, så GFP (380-460 nm) bruges til at se på prøver. Indstil eksponeringstiden til 500 ms for at tage billeder.
    2. Først skal hornhinden plade under stereoskop og fange billederne ved den laveste forstørrelse af 7,5x. Følg dette op med en række stigende forstørrelsesbilleder (f.eks. 15x, 25x, 35x), så al viral spredning og dendritdannelse visualiseres tydeligt
    3. Sørg for at returnere de inficerede hornhinder tilbage i vævskultur inkubatoren og gemme alle de billeder, der blev taget.
  3. Kvantificering af virusinfektion
    BEMÆRK: Virus titere fra porcine hornhinder bør evalueres hver dag for at analysere effekten af lægemiddelbehandling.
    1. For at kvantificere virus, frø Vero celler ved en tæthed på 5 x 105 af celler pr godt, hvis du bruger en 6-brønds plade som gjort i dette eksperiment. Gør dette en dag før infektionen. Inkuber de belagt celler natten over for at sikre, at de er sammenflyttede til viruskvantificering.
    2. Aliquot 500 μL serum frie medier i flere mikrocentrifuge rør. Indsæt steril bomuldspids podning dyppet i serum frie mediefyldte rør. Vatpindene skal dyppes og fugtes i mindst 5 minutter før brug.
    3. Uden at forstyrre de underliggende medier, transportere den inficerede svin hornhin hornhin plade i en biosikkerhed kabinet. Ved hjælp af de våde vatpinde skal du lave 3 omdrejninger med uret og 3 omdrejninger mod uret med en diameter på 5 mm fra midten af den inficerede svine hornhinde uden at anvende for stort tryk.
    4. Sæt vatpinden tilbage i serumfri mediefyldte mikrocentrifugerør, og roter den med uret og mod uret 5 gange. Bomuldsvaberens metalspids skal skæres, så den passer helt ind i mikrocentrifugerøret, og låget kan lukkes.
    5. Placer mikrocentrifugerøret, der indeholder vatpindet bomuldsspids, på en vortex-maskine og vortex ved høj hastighed i 1 min.
    6. Udfør virus kvantificering via en plak assay på disse prøver.
      BEMÆRK: Dette kvantificeringstrin skal udføres på dag 2, 4 og eventuelt på 6 dage efter infektion.
  4. Virus kvantificering ved plaque assay
    BEMÆRK: For at udføre en plak assay, vokse og plade Vero celler i en 6 brønd plade og sikre 90% sammenløb af celler, før starten af analysen. Brug et sammenløb 75 cm2 kolbe af disse celler. Alle nedenstående trin skal udføres inde i et biosikkerhedskab.
    1. Konfluent monolag af Vero-celler i kolben med 10 mL frisk fosfatbuffer saltvand (PBS) efter indsugning af kulturmediet. Gentag vasketrinnet igen med PBS efter at have aspirere det første sæt vaskeopløsning.
    2. Der tilsættes 1 mL 0,05% Trypsin til cellemonomeren. Kolben inkuberes ved 37 °C i 5 min. Med det blotte øje skal du sørge for, at cellerne løsnes fra kolbens indvendige overflade. Hvis ikke, skal du vente yderligere 5 minutter, før du undersøger kolben igen. Når celler ser ud til at være løsrevet, tilsættes 9 mL hele medier til monolag for at sikre, at cellerne løsner sig helt fra kolbeoverfladen.
    3. Saml alle cellerne fra kolben sammen med hele mediet og læg dem i et 15 mL centrifugerør.
    4. For hver brønd af de 6 brøndplader, der bruges til plakanalyse, skal du bruge 300 μL fra centrifugerøret. Fyld hver brønd af 6 brøndpladen med 2 mL hele medier. Lad pladerne i inkubatoren natten over for at give dem mulighed for at vokse og danne et sammenflyt monolag i hver brønd.
    5. For at udføre en plakanalyse skal der foretages en seriel fortynding af prøver, før kvantificeringen af virus.
    6. Udfør en log101 gange fortynding af virus i mikrocentrifugerør ved hjælp af serumfri medier, indtil en fortynding på 10-8 er nået. Når der ved en 10-3 fortynding overføres 1 mL af fortyndingen til monolag af lagte celler efter at have aspireret vækstmedierne på cellerne fra 6 brøndpladen, vil dette være infektionstrinnet. Inkuberes den inficerede plade ved 37 °C inkubator i 2 timer.
    7. Aspirere de eksisterende infektion medier, vaske med PBS to gange forsigtigt at pels celler og tilføje 2 mL af methylcellulose lastet medier pr godt til alle 6 brønde. Inkuber i 72 timer eller indtil dannelse af plaques kan ses. Plaques kan identificeres ved dannelsen af små mellemrum mellem celler i cellemonomeren.
    8. Tilsæt 1 mL methanol langsomt til hjørnet af hver brønd, ved hjælp af væggen som vejledende spids. Inkuber 6 brøndpladen ved stuetemperatur i 15 minutter. Langsomt aspirere indholdet af hver brønd fra pladen uden at forstyrre eller ophidse cellen monolayer.
    9. Tilsæt 1 mL krystal violet arbejdsopløsning til hver brønd på 6 brøndplade, hvilket sikrer, at alle celler er dækket. Inkuber 6 brøndpladen i mørket i 30 minutter. Kassér krystal violet opløsning ved at aspirere det og tørre brønde på et ark absorberende papir.
    10. Tæl antallet af plaques ved den højeste fortyndingsyd brønd for at kvantificere det samlede virusindhold i startopløsningen. Gentag processen to gange for at bekræfte den virale titer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at forstå effekten af de eksperimentelle antivirale lægemidler skal de testes grundigt, før de sendes til in vivo humane kliniske forsøg. I den forbindelse skal der identificeres positiv kontrol, negativ kontrol og testgrupper. Trifluorothymidin (TFT) har længe været anvendt som den foretrukne behandling til behandling af herpes keratitis topisk16. Anvendes som en positiv kontrol, TFT behandlet hornhinde grupper viser lavere infektion spredning. Som en negativ kontrol brugte vi DMSO eller køretøjskontrol opløst i PBS. BX795, det eksperimentelle prækliniske lægemiddel var testgruppen. I alt 4 hornhinder blev tildelt hver gruppe, og narkotika blev tilføjet 3 gange hver dag til porcine hornhinder. Vores resultater ved hjælp af stereoskopisk fluorescensbilleddannelse viser, at den antivirale effekt af BX795 ligner TFT i at kontrollere viral spredning. Viral spredning i vores undersøgelser kan visualiseres ved billeddannelse den grønne fluorescens kanal i stereoskopet. Vi observerede, at køretøjet kun behandlede negativ kontrolgruppe hornhinder viste spredning af virus fra den centrale infektion zone til periferien med 6 dage efter indledende viral podning, mens begge lægemidler (BX795 og TFT) klare infektionen i dag 4 - 6 billeder (Figur 9A). På samme måde viser de okulære podninger, der er taget på dag 2 og 4 efter infektionen, en fuldstændig hæmning af virus i de positive kontrol- og BX795-behandlede prøver, mens der observeres en kraftig stigning i infektiøs virustiter i den negative kontrolgruppe (Figur 9B).

Figure 1
Figur 1: Porcine øjne holdes på is, indtil væv er behandlet.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af arbejdsbænk.

Figure 3
Figur 3: Porcine øjne placeret på gaze.

Figure 4
Figur 4: Porcine eye med 30G nål afbilledet.

Figure 5
Figur 5: 30 G nåle, hul lavet i midten af epiteloverfladen.

Figure 6
Figur 6: Roterende handling, der bruges til at skære rundt hornhinde ved hjælp af skarpe steriliserede blade (A,B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Hornhinde billeder. (A,B) Hornhinden endelig skåret ved hjælp af skarp saks(C) Isoleret hornhinde holdes af pincet(D) Helt isoleret hornhinde, klar til brug Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Hornhinder placeret i 12-brønds plade og inkuberet i 72 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Progression af virusspredning taget under infektionsforløbet. Friskudskårne svin hornhinder blev inficeret med HSV-1 17-GFP og (A) afbildet ved hjælp af mikroskop på dag 2, 4 og 6 post infektion. Aktuel behandling med DMSO, TFT eller BX795 blev startet på dag 2 efter infektion. (B) Plaque assays blev udført ved hjælp af podninger taget fra porcine hornhinde som følge af Vero-celler. Tovejs ANOVA-testen blev udført for at forstå betydelige forskelle mellem behandlingsgrupperne. n=4, ****p=0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere forskning har vist BX795 at have en lovende rolle som et antiviralt middel mod HSV-1 infektion; ved at hæmme tank-bindende kinase 1 (TBK1)16. Både TBK1 og autofagi har spillet en rolle i at hjælpe hæmme HSV-1 infektion som påvist på humane hornhinde epitelceller. BX795 viste sig at være maksimalt effektiv med antivirale aktiviteter i en koncentration på 10μM og ved hjælp af både western blot analyse og viral plaque analyse af centrale virale proteiner, BX795 viste sig at hæmme HSV-1 infektion sammenlignes med aktiviteten af TFT16. Undersøgelsen af hornhindekorn fulgte samme analyse og opnåede lignende resultater som påvist ovenfor; BX795 viser sig at være lige så effektiv som TFT i at hæmme infektion - billeder taget af porcine hornhinder på dag 4 og 6 af infektion viser sammenlignelige resultater i både TFT og BX795. Plaque assays udført for at kvantificere udskilles virions også styrke disse resultater16. BX795 har også vist sig at have antivirale virkninger in vitro og dens anvendelse topisk i musemodeller in vivo har også vist undertrykkelse af hornhinde HSV-1 infektion16.

Studiet bidrager til at etablere BX795 som en effektiv og førende forbindelse til bredspektret antiviralt anvendelse mod HSV-1-infektion. Ved at vise dens effektivitet i porcine modeller som kan sammenlignes med TFT, BX795 står til at blive en succes i flere infektion modeller16. Derudover er BX795 vigtig, da det har vist sig at være effektivt i flere virusstammer, selv HSV-1 (KOS) tk12, som er resistent over for et andet meget anvendt lægemiddel Acyclovir (ACV)16. BX975 behandlede celler viser meget lidt udtryk for HSV-1 viral protein gB, som bekræfter sin hæmning effekt af HSV-1 virus. BX795 er også viser bedre anti-viral effekt ved lavere doser i forhold til andre behandlinger og anti-herpesvirus behandlinger. Desuden viser terapeutiske koncentrationer af BX795 (selv foreslået koncentration på 10 μM) ingen negativ cytotoksicitet over for celler - ingen apoptose inducering og celledød, som igen kan sammenlignes med TFT-kontrol16.

Kritiske trin i protokolsektionen omfatter isolering af svin hornhinde fra hele øjet. Dette indebærer debridement af hornhinden i midten af øjet ved hjælp af en nål og kræver meget lidt kraft for at sikre ingen stromal involvering efterfulgt af excising hornhinden fra den okulære overflade forsigtigt uden at forstyrre iris. Et andet sæt af kritiske trin omfatter dele, der involverer forfugtning bomuld tips og swabbing hornhinden overflade. Bevægelsen skal være skånsom for at sikre, at hornhinde epitel ikke løsnes fra den okulære overflade.

Ændring kan ske til epitel debridement trin. I stedet for at bruge en 30 G nål til at lave et enkelt prik i midten af hornhinden, kan eksperimentatoren bruge et sterilt blad eller en 30 G nål til forsigtigt at lave gitterformede ridser til hornhinden epitel. Dette sikrer robust infektion til epitelet.

Porcine hornhindeas bør anvendes på samme dag for indkøb og bør ikke holdes i længere tid end 24 timer. Porcine hornhindesiaer holdes i is i længere tid end 4 timer vil resultere i iris klæber til hornhinden. Dette gør det sværere at adskille hornhinden fra resten af øjet under excision. Ikke alle porcine hornhinder vil blive smittet ens. Forsøgspersonen skal inficere mindst 5 øjne pr. gruppe og derefter vælge lige så inficerede hornhinder på dag 2 efter infektion for at fortsætte med eksperimentet.

Betydningen af den nuværende teknik indebærer omkostningseffektiviteten af at bruge svin over menneskelige hornhinder. Teknikken er også signifikant på grund af den relative friskhed af hornhinder, der anvendes i forhold til menneskelige hornhinder.

Fremtidige anvendelser af den nuværende teknik omfatter, men ikke begrænset til, dens anvendelse i test af lægemiddel permeabilitetsundersøgelser, ex vivo farmakokinetiske og farmakodynamiske undersøgelser. Porcine hornhin hornhinder kan også bruges til at teste antibakterielle og svampedræbende lægemidler ud over antivirale lægemidler. Hornhinder kan også bruges til ex vivo sårheling assays til at studere diabetiske sår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt og ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud (R01 EY024710, RO1 AI139768, og RO1 EY029426) til D.S. A.A. blev støttet af en F30EY025981 tilskud fra National Eye Institute, NIH. Undersøgelsen blev udført ved hjælp af porcine hornhinder opnået fra Park Packing selskab, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G hypodermic needles. BD 305128
500 mL glass bottle. Thomas Scientific 844027
Antimycotic and Antibiotic (AA) GIBCO 15240096 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer. BioDot BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. Thermofisher Scientific Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. Puritan 22029501
Cell scraper - 25 cm Biologix BE 70-1180 70-1250
Crystal violet Sigma Aldrich C6158 Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM GIBCO 41966029 Store at 4 °C until use
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Fetal bovine serum -FBS Sigma Aldrich F2442 Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2. Harward Instruments 72-8595
Freezers --80 °C. - Thermofisher Scientific 13 100 790
Fresh box of blades. Thomas Scientific TE05091
Guaze Johnson & Johnson 108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP grown in house - Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS GIBCO 41400045 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer. Thomas Scientific H3710-HS
Metallic Scissors. Harward Instruments 72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL. Thomas Scientific 1159M37
Minimum Essential Medium - MEM GIBCO 11095080 Store at 4 °C until use
OptiMEM  GIBCO 31985047 Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin. GIBCO 15140148 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS GIBCO 10010072 Store at room temperature
Porcine Corneas Park Packaging Co., Chicago, IL Special order by request
Procedure bench covers - as needed. Thermofisher Scientific S42400
Serological Pipettes Thomas Scientific P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment. Thomas Scientific Ezpette Pro
Stereoscope Carl Zeiss SteREO Discovery V20
Stirring magnet. Thomas Scientific F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2. Thomas Scientific T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. Thermofisher Scientific Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well). Thomas Scientific T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25-300-062 Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells American Type Culture Collection ATCC CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
  2. Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
  3. Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
  4. Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
  5. Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
  6. Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
  7. Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
  8. Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
  9. Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
  10. Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
  11. Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
  12. Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
  13. Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
  14. Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
  15. Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
  16. Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
  17. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).

Tags

Immunologi og infektion Problem 175 ex-vivo hornhinde herpes simplex virus type-1 antivirale BX795 okulær infektion
Porcine Hornhin Tissue Explant at studere effekten af Herpes Simplex Virus-1 Antivirale lægemidler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, T., Volety, I., Shukla,… More

Yadavalli, T., Volety, I., Shukla, D. Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals. J. Vis. Exp. (175), e62195, doi:10.3791/62195 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter