Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62195
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Illinois at Chicago

Summary

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

Abstract

וירוסים וחיידקים יכולים לגרום למגוון פגמים בקרצוף העין והתנוונות כגון פצעים וכיבים באמצעות זיהום בקרנית. עם seroprevalence הנע בין 60-90% ברחבי העולם, וירוס הרפס סימפלקס סוג-1 (HSV-1) בדרך כלל גורם נגעים ריר של האזור orofacial אשר באים לידי ביטוי גם כמו נגעים ועיוורון הקשורים לזיהום. בעוד התרופות האנטי ויראליות הנוכחיות יעילות, הופעת ההתנגדות וההתמדה של תופעות לוואי רעילות מחייבת פיתוח של תרופות אנטי ויראליות חדשניות נגד פתוגן זה בכל מקום. למרות בהערכת במבחנה מספק כמה נתונים פונקציונליים לגבי אנטי ויראלי המתעורר, הם אינם מדגימים את המורכבות של רקמת העין ב vivo. עם זאת, במחקרים vivo הם יקרים דורשים כוח אדם מאומן, במיוחד כאשר עובדים עם סוכנים ויראליים. לפיכך דגמי ex vivo הם צעדים יעילים אך זולים לבדיקות אנטי ויראליות. כאן אנו דנים בפרוטוקול לחקר זיהום על ידי HSV-1 באמצעות קרניות חזיר ex vivo ושיטה לטיפול בהם באופן מקומי באמצעות תרופות קיימות וחדשניות. אנו גם מדגימים את השיטה לביצוע ביצוע פלאק באמצעות HSV-1. השיטות המפורטות עשויות לשמש לעריכת ניסויים דומים לחקר זיהומים הדומים לפתוגן HSV-1.

Introduction

אנשים הסובלים מזיהומים בעיניים לעתים קרובות נגרמים אובדן ראייה1. עם seroprevalence גבוה ברחבי העולם, אנשים נגועים HSV סובלים דלקות עיניים חוזרות אשר מובילים הצטלקות קרנית, קרטיטיס סטרומה וניאווסקולריזציה2,3,4,5. זיהומים HSV הראו גם לגרום בתדירות נמוכה יותר, מגוון של מצבים חמורים בקרב immunocompromised, חולים לא מטופלים כמו דלקת המוח ותחלואה מערכתית6,7,8. תרופות כמו Acyclovir (ACV) ואנלוגי הנוקלאוזיד שלה הראו הצלחה עקבית בריסון זיהום HSV-1 ואפילו לשלוט בהפעלה מחדש, אך השימוש הממושך בתרופות אלה קשור לאי ספיקת כליות, חריגות עובריות ואי הגבלת הופעת עמידות לסמים לזנים ויראליים מתפתחים9,10,11,12,13. מורכבויות הקשורות לזיהומים עיניים HSV-1, נחקרו בעבר במבחנה באמצעות monolayers ו תרביות 3D של תאי הקרנית האנושיים in vivo באמצעות זיהומים מורין או עיני ארנב. בעוד מודלים במבחנה אלה מספקים נתונים משמעותיים על הרכיבים הביולוגיים התאיים של זיהומים HSV-1, הם, עם זאת, אינם מצליחים לחקות את המורכבות המורכבת של רקמת הקרנית ולא עושים הרבה כדי להאיר את ההתפשטות הדנדריטית של הנגיף14. לעומת זאת, למרות שבמערכות vivo תובנות יותר בהצגת התפשטות זיהום בקרנית ותגובות הפעלה חיסוניות במהלך זיהום HSV-1, הם מגיעים עם האזהרה כי הם דורשים חוקרים מיומנים ומתקנים גדולים לטיפול בבעלי חיים להתעלם מהניסויים.

כאן אנו משתמשים בקרנית חזירים כמודל ex vivo כדי לבחון את מערכת הפצע המושרה זיהום HSV-1. הן את הפרמקולוגיה הפוטנציאלית של תרופות מסוימות, כמו גם את התא ואת הביולוגיה המולקולרית של מערכת הפצע הנגרמת על ידי הזיהום ניתן ללמוד באמצעות תרביות explant רקמות. מודל זה עשוי להיות מתוקן גם לשימוש עבור זיהומים ויראליים וחיידקיים אחרים גם כן. במחקר זה, קרניות חזיר שימשו כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של מולקולה קטנה פרה-קלינית, BX795. השימוש בקרניות חזירים היה מועדף בשל קלות הגישה וחסכונות העלות. בנוסף, מודלים קרנית חזיר הם מודלים טובים של עיניים אנושיות עם קרניות להיות קל לבודד, בגודל נאות עבור זיהום ויזואליזציה וחזק להתמודד עם15. קרניות חזירים דומות גם למורכבות של מודלים קרניים אנושיים הן בחדירה לקרנית טרנס והן בספיגה מערכתית15. באמצעות מודל זה למחקר, הצלחנו להבהיר כיצד BX795 ראוי לחקירה נוספת כמעכב מוסמך של זיהום וירוס HSV-1 ומוסיף לספרות של סיווגו כתרכובת אנטי ויראלית פוטנציאלית של מולקולה קטנה16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל רקמת החזיר המשמשת במחקר זה סופקה על ידי ארגון פרטי של צד שלישי ואף אחד מהטיפול בבעלי חיים לא בוצע על ידי אוניברסיטת אילינוי באנשי שיקגו.

1. חומרים

  1. ריאגנטים
    1. השתמש ריאגנטים הבאים לבדיקת פלאק: אבקת methylcellulose, מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין וסטרפטומיצין (P /S) לבדיקת פלאק.
    2. השתמש טבליות סגול קריסטל ואתנול (כיתה ביולוגיה מולקולרית) להכנת פתרון סגול קריסטל לבדיקת פלאק.
  2. מדיה צמיחה תא Vero - מדיה שלמה DMEM
    1. פתח את בקבוק המדיה DMEM בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. הסר 55 מ"ל של מדיה מהבקבוק באמצעות pipette סרולוגי להשליך אותו. הוסף 50 מ"ל של FBS של P/S ל- DMEM. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. פלאק אסאי מדיה - מניה של 5% מתילקולוז מדיה
    1. מדוד 2.5 גרם של אבקת מתילצלולוז עם מגנט ערבוב בתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל וסגור אותו אוטומטית. לאחר הבקבוק מתקרר לטמפרטורת החדר, לקחת 500 מ"ל של מדיה שלמה DMEM המכיל 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של P / S ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית המכיל methylcellulose.
    2. מערבבים את זה ב 4 °C במשך 2 ימים באמצעות stirrer מגנטי. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. הכנה תקשורתית לקרנית חזירית מובאת
    1. פתח בקבוק מדיה חיונית מינימלית (MEM) בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. יש להשליך 10 מ"ל של MEM מהבקבוק באמצעות פיפטה סרולוגית.
    2. הוסיפו 5 מ"ל של אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) ו-5 מ"ל של אנטי-מיקוטית-אנטיביוטיקה (AA) לתקשורת והכניסו למקרר ל-4 מעלות צלזיוס.
  5. מאסטר ומלאי עובד של סגול קריסטל:
    1. כדי להפוך את פתרון מלאי סגול קריסטל, להוסיף 1 גרם של אבקת סגול קריסטל ל 100 מ"ל של 20% אתנול במים. מניה זו (1% w / v קריסטל סגול) ניתן לאחסן ולהשתמש עד שנה כאשר מאוחסן במקום חשוך.
    2. כדי להפוך מלאי עובד מזה, להוסיף 50 מ"ל של פתרון מלאי מקורי 350 מ"ל של מים. הוסף 100mL של אתנול לפתרון זה כדי להפוך 500 mL עובד קריסטל סגול פתרון (0.1% w / v קריסטל סגול).
      הערה: שני פתרונות אלה צריכים להיות מאוחסנים בחושך.

2. הליך

  1. בידוד של קרניות חזירים מעיניים שלמות17
    1. עם קבלת עיני החזיר ממוכר מתאים, יש לאחסן בקרח אם יש עיכוב בעיבוד רקמות כפי שמצולמים באיור 1.
    2. ודא כי ציוד הגנה אישי משמש ושחוק במהלך הליך זה כדי למנוע זיהום, כמו גם תאונות משפוך של הומור הזגום.
    3. לרסס את אזור העבודה עם 70% אתנול כדי לנקות ולחטא. כדי להבטיח שמרחב העבודה יציב, פזורו כיסוי ספסל והדביקו את הצדדים בצורה מאובטחת כפי שהם בתמונה באיור 2.
    4. הניחו עיני חזיר על גזה(איור 3). בעזרת גזה בקוטר 50 מ"מ, יש להחזיק את החלק האחורי (איור 4A)של עיני חזיר כפי שמוצג באיור 4B ביד אחת.
    5. בעזרת מחט של 30 גרם, הכינו בעדינות דקירה בודדת במרכז המשטח האפיתל של העין בזהירות וודאו שאין נזק לסטרומה(איור 5). הדקירה צריכה להיות מוגבלת לאפיתל (~ 100-200 מיקרומטר) כדי למנוע מעורבות סטרומה.
    6. באמצעות להב מעוקר חד, לעשות עיגול קטן על sclera במרחק 1 מ"מ מן הקרנית. חותכים את קצה הקרנית ומבטיחים שההומור הזגג לא ידלוף באמצעות פעולה מסתובבת מהירה וחלקה של היד(איור 6A). על ידי החזקת הקרנית בקצה הקרנית-סקלרה עם פינצטה שטוחה, חתוך את שאר ממברנות קשירה של העין באמצעות הלהב(איור 6B).
    7. קח את הקרנית ומניחים אותו בצלחת 12-well מכוסה עם 2 מ"ל של קרנית בינונית. הקרנית צריכה להיות ממוקמת עם הפנים כלפי מעלה, המודגמת בסדרת שלבים באיור 7A-D, איור 8).
    8. הוסף 5 μL של פתרון הווירוס המכיל 5 x 105 יחידות יצירת פלאק (PFU) של 17 GFP לאתר מושמץ על פני הקרנית. מניחים את הצלחת 12-well המכיל קרני חזיר נגועות באינקובטור עם 5% CO2 עבור 72 שעות.
    9. יש לרסס לעיניים נוספות שלא נעשה בהן שימוש בניסוי עם 10% אקונומיקה ולהשליך בבטחה בשקיות ביולוגיות.
  2. ויזואליזציה
    הערה: יש לדמיין את הנגיף כל יום לפני הוספת תרופות.
    1. הפעל את מיקרוסקופ הסטריאו ואת מקור אור ה- LED ואפשר למנורת המכונה להתחמם לפני הדמיית הקרניות. בזהירות לשאת את צלחת הקרנית למכשיר מבלי להפריע לפתרון. שנה את המסנן כך ש- GFP (380-460 ננומטר) ישמש להסתכל על דגימות. הגדר את זמן החשיפה ל- 500 ms כדי ללכוד תמונות.
    2. ראשית, מניחים את צלחת הקרנית מתחת לסטריאוסקופ ולוכדים את התמונות בהגדלה הנמוכה ביותר של 7.5x. עקוב אחר זה עם סדרה של תמונות הגדלה הולכות וגדלות (למשל, 15x, 25x, 35x) כך שכל ההתפשטות הנגיפית ויצירת דנדריט דמיינו בבירור
    3. הקפד להחזיר את הקרניות הנגועות בחזרה לאינקובטור תרבית הרקמות ולשמור את כל התמונות שצולמו.
  3. כימות זיהום וירוס
    הערה: טיטרים וירוס מן קרניות חזיר יש להעריך כל יום כדי לנתח את ההשפעה של טיפול תרופתי.
    1. כדי לכמת וירוס, זרע תאי Vero בצפיפות של 5 x 105 של תאים לבאר אם באמצעות צלחת 6-טוב כפי שנעשה בניסוי זה. עשה זאת יום לפני ההדבקה. לדגור על התאים מצופים לילה כדי להבטיח שהם ממפגש לכימות וירוסים.
    2. Aliquot 500 μL של מדיה חופשית בסרום לתוך צינורות microcentrifuge מרובים. הכנס ספוגית כותנה סטרילית טבולה לתוך צינורות מלאים מדיה חינם סרום. דגימות הכותנה צריכות להיות טבולות ומרטיבות לפחות 5 דקות לפני השימוש.
    3. מבלי להפריע לתקשורת הבסיסית, העבירו את צלחת הקרנית החזירית הנגועה לארון בטיחות ביולוגית. באמצעות צמר גפן רטוב, לעשות 3 מהפכות בכיוון השעון ו 3 מהפכות נגד כיוון השעון בקוטר של 5 מ"מ ממרכז הקרנית החזירית הנגועה מבלי להפעיל לחץ מוגזם.
    4. הכנס בחזרה את ספוגית הכותנה לתוך צינור microcentrifuge מלא מדיה סרום ולסובב אותו בכיוון השעון ואנטי בכיוון השעון 5 פעמים. קצה המתכת של ספוגית הכותנה צריך להיחתך כך שהוא מתאים לחלוטין לצינור microcentrifuge ואת המכסה ניתן לסגור.
    5. מניחים את צינור microcentrifuge המכיל את קצה הכותנה הספוג על מכונת מערבולת ומערבולת במהירות גבוהה במשך 1 דקות.
    6. בצע כימות וירוס באמצעות מנסרה פלאק על דגימות אלה.
      הערה: שלב כימות זה צריך להתבצע בימים 2, 4 ובאופן אופציונלי על 6 ימים לאחר ההדבקה.
  4. כימות וירוסים על ידי פלאק אסייד
    הערה: כדי לבצע פלאק אסייד, לגדול צלחת תאי Vero לתוך צלחת 6 היטב ולהבטיח 90% השפעה של תאים לפני תחילת מבחנה. השתמש בבקבוק 75 ס"מ2 של תאים אלה. כל השלבים שלהלן צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. לשטוף את monolayer confluent של תאי Vero בבקבוקון עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט טרי (PBS) לאחר שאיפה מדיום התרבות. חזור על שלב הכביסה שוב עם PBS לאחר שאיפה את הסט הראשון של פתרון לשטוף.
    2. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין למונו-שכבתית של התא. לדגור על הבקבוקון ב 37 °C (5 דקות). בעין בלתי, ודא שהתאים מנותקים מפני השטח הפנימיים של הבקבוקון. אם לא, המתן עוד 5 דקות לפני שתבחן שוב את הבקבוקון. כאשר נראה שהתאים מנותקים, הוסף 9 מ"ל של מדיה שלמה למונו-שכבתית כדי להבטיח שהתאים יתנתקו לחלוטין ממשטח הבקבוק.
    3. לאסוף את כל התאים מן הבקבוק יחד עם התקשורת כולה ומניחים אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    4. עבור כל באר של 6 צלחות היטב המשמשים לבדיקת פלאק, להשתמש 300 μL מן צינור צנטריפוגה. למעלה כל באר של צלחת 6 היטב עם 2 מ"ל של מדיה שלמה. השאירו את הצלחות באינקובטור למשך הלילה כדי לאפשר להם לגדול וליצור מונולייר משוחח בכל באר.
    5. על מנת לבצע בדיקת פלאק, לבצע דילול סדרתי של דגימות צריך להתבצע לפני כימות הנגיף.
    6. בצעדילול פי 101 של הנגיף בצינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות מדיה חופשית בסרום עד לדילול של 10-8 הוא הגיע. כאשר ב 10-3 דילול, להעביר 1 מ"ל של דילול למונולייר של תאים מצופים לאחר שאיפה את מדיה הצמיחה על התאים מן צלחת 6 באר, זה יהיה שלב הזיהום. לדגור את הצלחת הנגועה ב 37 °C אינקובטור במשך 2 שעות.
    7. שאפו את אמצעי ההדבקה הקיימים, שטפו עם PBS פעמיים בעדינות כדי לצפות תאים והוסיפו 2 מ"ל של מדיה עמוסה במתיל צלולוז לכל באר לכל 6 בארות. דגירה במשך 72 שעות או עד היווצרות של לוחות ניתן לראות. לוחות ניתן לזהות על ידי היווצרות של פערים קטנים בין תאים ב monolayer התא.
    8. הוסף 1 מ"ל של מתנול לאט לפינה של כל באר, באמצעות הקיר כקצה מנחה. לדגור על צלחת 6 באר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאט לאט לשאוף את התוכן של כל באר מהצלחת מבלי להפריע או להסעיר את monolayer התא.
    9. הוסף 1 מ"ל של קריסטל סגול עובד פתרון לכל באר של 6 צלחת היטב, הבטחת כל התאים מכוסים. לדגור על צלחת 6 היטב בחושך במשך 30 דקות. יש להשליך את תמיסת הגביש הסגול על ידי שאיפתה ולייבש את בארות על גיליון נייר סופג.
    10. ספירת מספר הלוחות בבאר הדילול הגבוהה ביותר כדי לכמת את תוכן הווירוס הכולל בפתרון ההתחלתי. חזור על התהליך פעמיים כדי לאשר את טיטר הנגיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להבין את היעילות של האנטי-ויראליים הניסיוניים, הם צריכים להיבדק בהרחבה לפני שהם נשלחים לניסויים קליניים בבני אדם של vivo. בהקשר זה, יש לזהות שליטה חיובית, שליטה שלילית וקבוצות בדיקה. Trifluorothymidine (TFT) שימש זמן רב כטיפול המועדף לטיפול הרפס קרטיטיס topically16. משמש כשליטה חיובית, קבוצות הקרנית שטופלו TFT להראות התפשטות זיהום נמוכה יותר. כשליטה שלילית, השתמשנו ב- DMSO או בבקרת רכב מומסת ב- PBS. BX795, התרופה הניסיונית פרה-קלינית הייתה קבוצת הבדיקה. בסך הכל הוקצו 4 קרניות לכל קבוצה והתרופות נוספו 3 פעמים בכל יום לקרניות החזירים. התוצאות שלנו באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות סטריאוסקופית מראות כי היעילות האנטי ויראלית של BX795 דומה ל- TFT בשליטה על התפשטות ויראלית. התפשטות ויראלית במחקרים שלנו יכולה להיות דמיונית על ידי הדמיית ערוץ הפלואורסצנטיות הירוקה בסטריאוסקופ. ראינו כי הרכב טיפל רק קרניות קבוצת בקרה שלילית הראה התפשטות של הנגיף מאזור ההדבקה המרכזי לפריפריה שלה על ידי 6 ימים לאחר חיסון ויראלי ראשוני, בעוד שתי התרופות (BX795 ו- TFT) לנקות את הזיהום ביום 4 - 6 תמונות(איור 9A). באופן דומה, דגימות העין שנלקחו בימים 2 ו -4 לאחר ההדבקה מראות עיכוב מוחלט של הנגיף בשליטה החיובית ודגימות שטופלו ב- BX795 בעוד עלייה חדה בטיטר הנגיף הזיהומי נצפתה בקבוצת הביקורת השלילית (איור 9B).

Figure 1
איור 1: עיני חזיר נשמרות על קרח עד לעיבוד הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הגדרת ספסל עבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עיני חזיר מונחות על גזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 4
איור 4: עין חזירית עם מחט 30G בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: 30 G מחט בשימוש; חור שנעשה במרכז משטח האפיתל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 6
איור 6: פעולה מסתובבת המשמשת לחיתוך קצה הקרנית באמצעות להב מעוקר חד (A,B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונות קרנית. (א,ב) הקרנית לבסוף לחתוך באמצעות מספריים חדים (C)קרנית מבודדת מוחזקת על ידי פינצטה (D)קרנית מבודדת לחלוטין, מוכן לשימוש אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 8
איור 8: קרניות ממוקמות בצלחת 12-well ודגרה במשך 72 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: התקדמות ההתפשטות הנגיפית שנלקחה במהלך ההדבקה. קרני חזירים טריים שנדבקו בקרנית HSV-1 17-GFP ו- (A) בתמונה באמצעות מיקרוסקופ בימים 2, 4 ו -6 לאחר זיהום. טיפול אקטואלי עם DMSO, TFT או BX795 החל ביום 2 לאחר ההדבקה. (ב)בוצעו מבאי פלאק באמצעות מטליות שנלקחו מהקרנית החזירית בתאי Vero. בדיקת ANOVA דו-כיוונית בוצעה כדי להבין הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול. n =4, ****p=0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים קודמים הראו BX795 יש תפקיד מבטיח כסוכן אנטי ויראלי נגד זיהום HSV-1; על ידי עיכוב קינאז מחייב טנק 1 (TBK1)16. הן TBK1 והן autophagy שיחקו תפקיד בסיוע לעכב זיהום HSV-1 כפי שהוכח על תאי אפיתל הקרנית האנושית. BX795 הוכח כיעיל ביותר עם פעילות אנטי ויראלית בריכוז של 10μM ושימוש הן ניתוח כתם מערבי וניתוח פלאק ויראלי של חלבונים ויראליים מפתח, BX795 הוכח לעכב זיהום HSV-1 דומה לפעילות של TFT16. המחקר על קרניות חזירים עקב אחר אותו ניתוח והשיג תוצאות דומות כפי שהוכח לעיל; BX795 מוצג כיעיל בדיוק כמו TFT בעיכוב זיהום - תמונות שצולמו של קרניות חזיר ביום 4 ו -6 של זיהום מראות תוצאות דומות הן TFT והן BX795. בוצעו גם עבירות פלאק כדי לכמת את הנגיפיםהמופרשים. BX795 הוכיח גם שיש השפעות אנטי ויראליות במבחנה והשימוש בו topically בדגמי עכבר ב vivo הראה גם דיכוי של זיהום HSV-1 קרנית16.

המחקר תורם לביסוס BX795 כתרכובת יעילה ומובילה ליישום אנטי-ויראלי רחב טווח נגד זיהום HSV-1. על ידי הצגת יעילותה בדגמים חזיריים כדומה ל- TFT, BX795 עומד להצליח במודלים מרובים של זיהום16. בנוסף, BX795 חשוב כפי שהוא הוכח להיות יעיל בזני וירוס מרובים, אפילו HSV-1 (KOS)tk12 אשר עמיד לתרופה אחרת בשימוש נרחב Acyclovir (ACV)16. BX975 תאים שטופלו להראות ביטוי קטן מאוד של HSV-1 חלבון ויראלי gB אשר מאשרים את יעילות העיכוב שלה של וירוס HSV-1. BX795 הוא גם מדגים יעילות אנטי ויראלית טובה יותר במינונים נמוכים יותר בהשוואה לטיפולים אחרים וטיפולים אנטי הרפס. יתר על כן, ריכוזים טיפוליים של BX795 (אפילו ריכוז מוצע של 10 מיקרומטר) מראים שום ציטוטוקסיות שלילית כלפי תאים - אין תמריץ אפופטוזיס ומוות תאים, אשר שוב דומה בקרת TFT16.

צעדים קריטיים בסעיף הפרוטוקול כוללים בידוד של קרנית חזירית מכל העין. זה כרוך בפירוק הקרנית במרכז העין באמצעות מחט ודורש מעט מאוד כוח כדי להבטיח שום מעורבות סטרומלית ואחריו כריתת הקרנית מפני השטח העין בעדינות מבלי להפריע הקשתית. קבוצה נוספת של צעדים קריטיים כוללת חלקים הכוללים קצות כותנה הרטבה מראש ונטיית פני הקרנית. התנועה צריכה להיות עדינה כדי להבטיח אפיתל הקרנית לא להיות מנותק מפני השטח העין.

שינוי יכול להיעשות לשלב הפירוק האפיתל. במקום להשתמש במחט 30 G כדי להפוך דחיפה אחת במרכז הקרנית, הנסיין יכול להשתמש בלהב סטרילי או מחט 30 גרם כדי להפוך בעדינות שריטות בצורת רשת לאפיתל הקרנית. זה מבטיח זיהום חזק לאפיתל.

קרנית חזירים צריך לשמש באותו יום של רכש ולא צריך להיות מוחזק במשך יותר מ 24 שעות. קרניות חזיריות שנשמרו בקרח במשך יותר מ-4 שעות יגרמו לאיריס להידבק לקרנית. זה מקשה על הפרדת הקרנית משאר העין במהלך כריתה. לא כל קרני החזירים יקבלו נגועים זהים. הנסיין צריך להדביק מינימום של 5 עיניים לכל קבוצה ולאחר מכן לבחור קרניות נגועות באותה מידה ביום 2 לאחר זיהום להמשיך עם הניסוי.

המשמעות של הטכניקה הנוכחית כרוכה בעלויות האפקטיביות של שימוש חזירי על קרניות אנושיות. הטכניקה היא משמעותית גם בגלל הרעננות היחסית של הקרניות בשימוש בהשוואה קרניות אנושיות.

יישומים עתידיים של הטכניקה הנוכחית כוללים אך לא מוגבל לשימוש שלה בבדיקת מחקרים חדור סמים, ex vivo פרמקוקינטית ומחקרים פרמקודינמיים. קרנית חזירים יכול לשמש גם כדי לבדוק תרופות אנטיבקטריאליות ואנטי פטרייתיות בנוסף תרופות אנטי ויראליות. הקרנית יכולה לשמש גם לבדיקות ריפוי פצעים ex vivo כדי לחקור פצעים סוכרתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים ואין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 ו- RO1 EY029426) ל- D.S. A.A. נתמך על ידי מענק F30EY025981 ממכון העיניים הלאומי, NIH. המחקר נערך באמצעות קרניות החזירים שהתקבלו מחברת Park Packing, שדרת אשלנד 4107, ניו סיטי, שיקגו, IL-60609

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G hypodermic needles. BD 305128
500 mL glass bottle. Thomas Scientific 844027
Antimycotic and Antibiotic (AA) GIBCO 15240096 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer. BioDot BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. Thermofisher Scientific Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. Puritan 22029501
Cell scraper - 25 cm Biologix BE 70-1180 70-1250
Crystal violet Sigma Aldrich C6158 Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM GIBCO 41966029 Store at 4 °C until use
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Fetal bovine serum -FBS Sigma Aldrich F2442 Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2. Harward Instruments 72-8595
Freezers --80 °C. - Thermofisher Scientific 13 100 790
Fresh box of blades. Thomas Scientific TE05091
Guaze Johnson & Johnson 108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP grown in house - Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS GIBCO 41400045 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer. Thomas Scientific H3710-HS
Metallic Scissors. Harward Instruments 72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL. Thomas Scientific 1159M37
Minimum Essential Medium - MEM GIBCO 11095080 Store at 4 °C until use
OptiMEM  GIBCO 31985047 Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin. GIBCO 15140148 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS GIBCO 10010072 Store at room temperature
Porcine Corneas Park Packaging Co., Chicago, IL Special order by request
Procedure bench covers - as needed. Thermofisher Scientific S42400
Serological Pipettes Thomas Scientific P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment. Thomas Scientific Ezpette Pro
Stereoscope Carl Zeiss SteREO Discovery V20
Stirring magnet. Thomas Scientific F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2. Thomas Scientific T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. Thermofisher Scientific Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well). Thomas Scientific T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25-300-062 Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells American Type Culture Collection ATCC CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
  2. Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
  3. Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
  4. Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
  5. Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
  6. Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
  7. Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
  8. Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
  9. Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
  10. Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
  11. Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
  12. Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
  13. Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
  14. Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
  15. Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
  16. Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
  17. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 175 לשעבר ויוו קרנית הרפס סימפלקס וירוס סוג 1 אנטי ויראלי BX795 זיהום עיני
רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, T., Volety, I., Shukla,… More

Yadavalli, T., Volety, I., Shukla, D. Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals. J. Vis. Exp. (175), e62195, doi:10.3791/62195 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter