زرع الورم في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر مع حاقن نانولتر تلقائي قابل للبرمجة
Summary
يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة لعملية زرع الأعضاء الأولية والمستمرة لأورام ذبابة الفاكهة في بطن المضيفين البالغين لدراسة الجوانب المختلفة للأورام. باستخدام جهاز الحقن الذاتي ، يمكن للباحثين تحقيق كفاءة محسنة وغلة الورم مقارنة بتلك التي تحققت بالطرق اليدوية التقليدية.
Abstract
يصف هذا البروتوكول عملية زرع الأورام في ذبابة الفاكهة باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي. باستخدام جهاز الحاقن الذاتي ، يمكن للمشغلين المدربين تحقيق نتائج زرع أكثر كفاءة واتساقا مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام حاقن يدوي. هنا ، نغطي الموضوعات بطريقة زمنية: من عبور خطوط ذبابة الفاكهة ، إلى تحريض وتشريح الورم الأساسي ، وزرع الورم الأساسي في مضيف بالغ جديد واستمرار زرع الورم من الأجيال لإجراء دراسات موسعة. كعرض توضيحي ، نستخدم هنا المجال داخل الخلايا Notch (NICD) الإفراط في التعبير الناجم عن أورام الحلقة اللعابية الوهمية لزرع الأجيال. يمكن أولا تحفيز هذه الأورام بشكل موثوق به في بيئة مجهرية في منطقة انتقالية داخل الحلقات التخيلية للغدة اللعابية اليرقية ، ثم يتم استزراعها واستزراعها في الجسم الحي لدراسة نمو الورم المستمر وتطوره وانبثاثه. يمكن أن تكون طريقة الزرع هذه مفيدة في برامج فحص الأدوية المحتملة ، وكذلك لدراسة التفاعلات بين الورم والمضيف.
Introduction
يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لزرع أورام الحلقة الوهمية للغدة اللعابية اليرقية (SG) في بطن المضيفين البالغين باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي (على سبيل المثال ، Nanoject). يوفر هذا البروتوكول أيضا توجيهات لإعادة تجميع الأورام لاحقا في أجيال جديدة من المضيفين البالغين ، مما يوفر فرصا لمواصلة الدراسة الطولية لخصائص الورم ، مثل تطور الورم والتفاعلات بين الورم والمضيف. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على تجارب فحص الأدوية.
تم تطوير هذه الطريقة لتحسين فعالية إجراء زراعة الأعضاء في ذبابة الفاكهة باستخدام الحقن اليدوي1 ، والتي غالبا ما تكون غير متسقة في قوى الشفط والحقن ، مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل لزراعة الورم. يوفر جهاز الحاقن الذاتي تحكما أفضل ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض معدلات وفيات الذباب بعد الألوغرافت. يمكن للمشغل المدرب تحقيق معدل بقاء المضيف على قيد الحياة يزيد عن 90٪ باستخدام الحاقن التلقائي ، مقارنة بحوالي 80٪ عند استخدام الحاقن اليدوي1. معدل اكتساب الورم الكلي هو 60٪ -80٪ في اليوم 8-12 بعد allograft. كما تم تحسين متوسط وقت الحقن من 30-40 ثانية لكل ذبابة باستخدام حاقن يدوي إلى 20-25 ثانية لكل ذبابة باستخدام الحاقن التلقائي.
هذا البروتوكول هو من بين البروتوكولات القليلة الأولى لاستخدام جهاز الحقن الذاتي في زراعة ورم ذبابة الفاكهة . كما استخدمت دراسة حديثة الحاقن الذاتي لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الورمية2. في السابق ، تم استخدام جهاز الحقن الذاتي في ذبابة الفاكهة لدراسة الضراوة البكتيرية3 والالتهابات الطفيلية ودفاع المضيف4 ، وكذلك فحص النشاط الحيوي للمركبات المختلفة5. يقوم بروتوكولنا بتكييف جهاز الحقن الذاتي لاستخدام حقن الورم ويسعى إلى تزويد الباحثين في ذبابة الفاكهة بجودة أعلى ونتائج أكثر اتساقا مع توفير وقت كبير لهم. لا يمكن استخدام هذا البروتوكول فقط لزراعة الأورام ، ولكن يمكن أيضا تخصيصه لزراعة الأعضاء البرية والأنسجة المتحولة ذات العيارالمماثل 6.
تم إدخال ورم ذبابة الفاكهة NICD المستخدم في هذا البروتوكول لأول مرة من قبل Yang et al.7 في المنطقة الانتقالية للحلقة الخيالية SG ، وهي “نقطة ساخنة للورم” تظهر مستويات عالية من Janus Kinase / محول الإشارة الداخلي ومنشطات النسخ (JAK-STAT) ، ونشاط c-Jun N-terminal Kinase (JNK). بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي المنطقة الانتقالية على مستويات عالية من مصفوفة ميتالوبروتيناز -1 (MMP1)7 ، مما يجعل هذه المنطقة مواتية بشكل خاص لتكوين الأورام. يعد تنشيط مسار الشق من خلال الإفراط في التعبير عن NICD وحده كافيا لبدء تكوين الورم باستمرار. يمكن لاحقا زرع هذه الأورام للسماح بالتحقيق في مجموعة واسعة من الموضوعات ، بما في ذلك انقسام الخلايا السرطانية ، والغزو ، والتفاعلات بين الورم والمضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يساعد زرع الورم الباحثين على معالجة بعض المشاكل التي تنشأ أثناء نمو ورم ذبابة الفاكهة وتقدمه. أحد هذه التحديات هو التحايل على الوفيات المبكرة لليرقات الحاملة للورم أو البالغين أثناء زراعة الورم الأولية12. في هذا السياق ، يسمح استمرار زراعة الورم للأورام بالنمو إل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء المختبر السابقين الدكتور شنغ آن يانغ والسيد خوان مارتن بورتيلا على مساهمتهم في تطوير هذا البروتوكول. نحن ممتنون لمختبر الدكتور يان سونغ في كلية علوم الحياة بجامعة بكين لمشاركة بروتوكولهم بشأن الزرع اليدوي. كما نشكر السيد كالدر إلسورث والسيد إيفرست شابيرو على القراءة النقدية للمخطوطة.
تلقت أسلحة الدمار الشامل تمويلا (GM072562 و CA224381 و CA227789) لهذا العمل من المعهد الوطني للصحة (https://www.nih.gov/) وتمويلا (IOS-155790) من المؤسسة الوطنية للعلوم (htps://nsf.gov/). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
Riferimenti
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
