Allotransplantation tumorale chez Drosophila melanogaster avec un injecteur auto-nanolitre programmable
Summary
Ce protocole fournit des conseils détaillés pour l’allotransplantation générationnelle initiale et continue des tumeurs de la drosophile dans l’abdomen des hôtes adultes pour étudier divers aspects de la néoplasie. En utilisant un appareil d’auto-injecteur, les chercheurs peuvent obtenir une efficacité et des rendements tumoraux améliorés par rapport à ceux obtenus par des méthodes manuelles traditionnelles.
Abstract
Ce protocole décrit l’allotransplantation des tumeurs chez Drosophila melanogaster à l’aide d’un appareil d’injection d’auto-nanolitres. Avec l’utilisation d’un appareil d’auto-injecteur, les opérateurs formés peuvent obtenir des résultats de transplantation plus efficaces et cohérents par rapport à ceux obtenus à l’aide d’un injecteur manuel. Ici, nous couvrons les sujets de manière chronologique: du croisement des lignées de drosophiles à l’induction et à la dissection de la tumeur primaire, en passant par la transplantation de la tumeur primaire dans un nouvel hôte adulte et la transplantation générationnelle continue de la tumeur pour des études approfondies. À titre de démonstration, nous utilisons ici des tumeurs de l’anneau imaginal induites par la surexpression du domaine intracellulaire Notch (NICD) pour la transplantation générationnelle. Ces tumeurs peuvent d’abord être induites de manière fiable dans un microenvironnement de zone de transition au sein des anneaux imaginaux des glandes salivaires larvaires, puis allogreffées et cultivées in vivo pour étudier la croissance tumorale continue, l’évolution et les métastases. Cette méthode d’allotransplantation peut être utile dans les programmes potentiels de dépistage de médicaments, ainsi que pour étudier les interactions tumeur-hôte.
Introduction
Ce protocole fournit un guide étape par étape pour l’allotransplantation des tumeurs de l’anneau imaginal des glandes salivaires larvaires (SG) de la drosophile dans l’abdomen d’hôtes adultes à l’aide d’un appareil d’injection d’auto-nanolitres (par exemple, Nanoject). Ce protocole fournit également des instructions pour la ré-allogreffe ultérieure des tumeurs dans de nouvelles générations d’hôtes adultes, ce qui offre des possibilités d’étude longitudinale continue des caractéristiques tumorales, telles que l’évolution tumorale et les interactions tumeur-hôte. Le protocole peut également être appliqué aux expériences de dépistage de drogues.
Cette méthode a été développée pour améliorer l’efficacité de l’allotransplantation tumorale chez la drosophile à l’aide d’injecteurs manuels1, qui sont souvent incohérents dans leurs forces d’aspiration et d’injection, conduisant à des résultats sous-optimaux pour l’allotransplantation tumorale. Un appareil d’auto-injection offre un meilleur contrôle et peut entraîner des taux plus faibles de mortalité des mouches après l’allogreffe. Un opérateur formé pourrait atteindre un taux de survie de l’hôte de plus de 90% avec l’auto-injecteur, contre environ 80% lorsque l’injecteur manuel était utilisé1. Le taux global d’acquisition tumorale est de 60% à 80% au jour 8-12 après l’allogreffe. Le temps d’injection moyen a également été amélioré, passant de 30 à 40 s par mouche à l’aide d’un injecteur manuel à 20 à 25 s par mouche à l’aide de l’auto-injecteur.
Ce protocole est l’un des premiers protocoles à utiliser l’appareil auto-injecteur dans l’allotransplantation tumorale de la drosophile . Une étude récente a également utilisé l’auto-injecteur pour l’allotransplantation de cellules souches neurales tumorales2. Auparavant, l’appareil d’auto-injecteur était utilisé chez la drosophile pour étudier la virulence bactérienne3, les infections parasitaires et la défense de l’hôte4, ainsi que le dépistage de la bioactivité de différents composés5. Notre protocole adapte l’appareil d’auto-injecteur pour l’utilisation de l’injection tumorale et cherche à fournir aux chercheurs de la drosophile une qualité supérieure et des résultats plus cohérents tout en leur faisant gagner un temps considérable. Ce protocole peut non seulement être utilisé pour l’allotransplantation de tumeurs, mais peut également être adapté à l’allotransplantation de tissus sauvages et mutants de calibre similaire6.
La tumeur NICD de drosophile utilisée dans ce protocole a été introduite pour la première fois par Yang et al.7 dans la zone de transition de l’anneau imaginal SG, un « point chaud tumoral » qui présente des niveaux élevés d’activité endogène Janus Kinase / Signal Transducer et Activateurs de transcription (JAK-STAT), et c-Jun N-terminal Kinase (JNK). De plus, la zone de transition présente des niveaux élevés de métalloprotéinase matricielle 1 (MMP1)7, ce qui rend cette région particulièrement propice à la tumorigenèse. L’activation de la voie notch par la surexpression de la NICD seule est suffisante pour initier systématiquement la formation de tumeurs. Ces tumeurs peuvent ensuite être allotransplantées pour permettre l’étude d’un large éventail de sujets, y compris la division des cellules tumorales, l’invasion et les interactions tumeur-hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’allotransplantation tumorale peut aider les chercheurs à résoudre certains problèmes qui surviennent au cours de la croissance et de la progression de la tumeur de la drosophile. L’un de ces défis est le contournement des décès prématurés de larves ou d’adultes porteurs de tumeurs lors de la culture de tumeursprimaires 12. Dans ce contexte, l’allotransplantation tumorale continue permet aux tumeurs de se développer indéfiniment, ce qui facilite les études longitudinal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les anciens membres du laboratoire, le Dr Sheng-An Yang et M. Juan-Martin Portilla, pour leur contribution à l’élaboration de ce protocole. Nous sommes reconnaissants au laboratoire du Dr Yan Song à l’École des sciences de la vie de l’Université de Pékin d’avoir partagé son protocole sur l’allotransplantation manuelle. Nous remercions également M. Calder Ellsworth et M. Everest Shapiro pour leur lecture critique du manuscrit.
WMD a reçu un financement (GM072562, CA224381, CA227789) pour ce travail du National Institute of Health (https://www.nih.gov/) et un financement (IOS-155790) de la National Science Foundation (htps://nsf.gov/). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
Riferimenti
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