כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי
Summary
Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר הגורם לדלקת קרום המוח יילודים. המופע של חיידקים וחדירה חיידקית דרך מחסום הדם – מוח הם צעדים הכרחיים להתפתחות של דלקת קרום המוח E. coli. מינים תגובתיים של חמצן (ROS) מייצגים את המנגנונים הבקטריואידיים העיקריים של נויטרופילים כדי להשמיד את הפתוגנים הפולשים. בפרוטוקול זה, ייצור ROS תאיים תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה לכמת באמצעות בדיקות ROS פלואורסצנטי זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה לחול גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים במהלך אינטראקציות מארח פתוגן.
Introduction
דלקת קרום המוח חיידקית יילודים היא מחלה זיהומית בילדים נפוצה. Escherichia coli (E. coli) עם כמוסה K1 הוא הפתוגן הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח חיידקי יילודים, המהווה כ 80% מכלל השכיחות1,2,3. למרות ההתקדמות בכימותרפיה מיקרוביאלית וטיפול תומך, דלקת קרום המוח חיידקית היא עדיין אחד התנאים ההרסניים ביותר עם תחלואה גבוההותמותה 4.
המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים בדרך כלל מתחיל עם חיידקים הנגרמים על ידי כניסת חיידקים פתוגניים לתוך זרימת הדם ההיקפית מן הנגעים המקומיים של התינוקות, ואחריו חדירה דרך מחסום הדם – מוח (BBB) לתוך המוח, וכתוצאה מכך דלקת של קרום המוח4. הופעת החיידק תלויה באינטראקציה בין חיידקים לתאי חיסון מארחים כולל נויטרופילים ומאקרופאגים וכו ‘. נויטרופילים, המהווים ~ 50-70% מתאי הדם הלבנים, הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים5,6. במהלך הפלישה של חיידקים, נויטרופילים מופעל מגויסים לאתרים זיהומיות ולשחרר מינים חמצן תגובתי (ROS) כולל אניון סופראוקסיד, מי חמצן, רדיקלים הידרוקסיל, וחמצןסינגלט 7. ROS לעבור תגובות redox עם קרום התא, מולקולות חומצת גרעין וחלבונים של החיידקים, וכתוצאה מכך פציעה ומוות של חיידקים פולשים8. המיטוכונדריה היא האתר העיקרי של ייצור ROS בתאים אוקריוטיים, ואוקסידאזים שונים (למשל, ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) קומפלקס אוקסידאז, מערכת ליפוקסיגנאז, חלבון קינאז C ומערכת ציקלואוקסיגניאז) מתווכים את הייצור של ROS9,10. המדידה בזמן אמת של הייצור של ROS, המייצג את המנגנון האנטי מיקרוביאלית העיקרית נויטרופילים, היא שיטה שימושית לחקר ההגנה המארחת במהלך האינטראקציה חיידקים מארח.
בפרוטוקול זה, ייצור ROS תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה מכמת עם DHE בדיקה ROS פלואורסצנטי, זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה להיות מיושמת גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים אחרים במהלך האינטראקציה פתוגן מארח.
Protocol
Representative Results
Discussion
נויטרופילים פועלים כמרכיב הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים במחזור הדם האנושי. הם תאים משפיעים חשובים במערכת החיסון האנושית המולדת, אשר בונה את קו ההגנה הראשון נגד הפלישה של פתוגנים11. הדור של ROS מייצג את אחד המנגנונים bactericidal העיקריים של נויטרופילים בעקבות phagocytosis11. מחקר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31670845, 31870832, 32000811) ותכניתו של פרופסור מצטיין במחוז ליאונינג (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
