Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica
Summary
La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli)es la bacteria Gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de bacteremia y penetración bacteriana a través de la barrera hematoencefálica son pasos indispensables para el desarrollo de la meningitis E. coli. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) representan los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos para destruir los patógenos invadidos. En este protocolo, la producción de ROS intracelular dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó utilizando sondas ROS fluorescentes detectadas por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en células de mamíferos durante las interacciones patógeno-huésped.
Introduction
La meningitis bacteriana neonatal es una enfermedad infecciosa pediátrica común. Escherichia coli (E. coli)con una cápsula K1 es el patógeno gram-negativo más común que causa meningitis bacteriana neonatal, representando alrededor del 80% de la incidencia total1,2,3. A pesar de los avances en la quimioterapia antimicrobiana y la atención de apoyo, la meningitis bacteriana sigue siendo una de las afecciones más devastadoras con alta morbilidad y mortalidad4.
La aparición de meningitis bacteriana neonatal generalmente comienza con la bacteremia causada por la entrada de bacterias patógenas en la circulación periférica de las lesiones locales de los recién nacidos, seguida de la penetración a través de la barrera blood – brain (BBB) en el cerebro, lo que resulta en la inflamación de las meninges4. La aparición de la bacteremia depende de la interacción entre las bacterias y las células inmunes huésped, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, etc. Los neutrófilos, que representan ~50-70% de los glóbulos blancos, son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas5,6. Durante la invasión de bacterias, los neutrófilos activados son reclutados en los sitios infecciosos y liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) incluyendo el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y oxígeno singlete7. El ROS se somete a reacciones redox con la membrana celular, moléculas de ácido nucleico y proteínas de la bacteria, lo que resulta en la lesión y muerte de la bacteria invasora8. Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ROS en células eucariotas, y varios oxidases (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) complejo oxidasa, sistema lipoxigenasa, proteína quinasa C y sistema ciclooxigenasa) median la producción de ROS9,10. La medición en tiempo real de la producción de ROS, que representa el mecanismo antimicrobiano primario en neutrófilos, es un método útil para estudiar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.
En este protocolo, la producción de ROS dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó con una sonda ROS fluorescente DHE, detectada por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en otras células de mamíferos durante la interacción patógeno-huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los neutrófilos actúan como el componente más abundante de los glóbulos blancos en la circulación sanguínea humana. Son células efectoras importantes en el sistema inmune humano innato, que construye la primera línea de defensa contra la invasión de patógenos11. La generación de ROS representa uno de los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos después de la fagocitosis11. Estudios recientes han demostrado que una estructura similar a la red liber…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31670845, 31870832, 32000811) y el Programa de Profesor Distinguido de la Provincia de Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
