Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

Abstract

מחקרים גנומיים פונקציונליים של המערכת החיסונית דורשים מניפולציות גנטיות הכרוכות הן במחיקת גנים ממוקדים והן בתוספת אלמנטים לחלבונים בעלי עניין. זיהוי פונקציות גנים במודלים של קו התא חשוב לגילוי גנים וחקירה של מנגנונים מהותיים של תאים. עם זאת, מניפולציות גנטיות של תאים חיסוניים כגון תאי T וקווי תאי מקרופאגים באמצעות נוק-אין בתיווך CRISPR/Cas9 קשות בגלל יעילות ההדבקה הנמוכה של תאים אלה, במיוחד במצב של ירידה. כדי לשנות גנים בתאי מערכת החיסון, בחירת עמידות לתרופות וקטורים ויראליים משמשים בדרך כלל להעשרה עבור תאים המבטאים את מערכת CRIPSR/Cas9, אשר בהכרח גורמת להתערבות בלתי רצויה של התאים. במחקר קודם, עיצבנו כתבים פלואורסצנטיים כפולים בשילוב CRISPR / Cas9 שבאו לידי ביטוי ארעי לאחר אלקטרופורציה. פתרון טכני זה מוביל למחיקת גנים מהירה בתאי מערכת החיסון; עם זאת, נוק-אין גנים בתאי מערכת החיסון כגון תאי T ו macrophages ללא שימוש בבחירת התנגדות לסמים או וקטורים ויראליים הוא אפילו יותר מאתגר. במאמר זה, אנו מראים כי באמצעות מיון תאים כדי לסייע בבחירת תאים המבטאים באופן ארעי מבנים CRISPR/Cas9 המתמקדים בלוקוס Rosa26 בשילוב עם פלסמיד תורם, ניתן להשיג נוק-אין גנטי הן בתאי T והן במקרופג'ים ללא העשרה עמידות לסמים. כדוגמה, אנו מראים כיצד לבטא ACE2 אנושי, קולטן של SARS-Cov-2, האחראי על מגיפת Covid-19 הנוכחית, במקרופגים RAW264.7 על ידי ביצוע ניסויים נוק-אין. תאים כאלה נוק-אין גנים ניתן להשתמש נרחב עבור מחקרים מכניים.

Introduction

תאי מערכת החיסון הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים. חסינות מולדת ומסתגלת נדרשים לפינוי זיהומים ותחזוקה של הומאוסטזיסרקמות 1,2. מודלים של קו התאים הם כלים חיוניים להבנת היסודות המולקולריים של מערכת החיסון של היונקים; הם משמשים במבחנה תפקודית בדיקות, כגון אלה מודל הפעלת תאי T אנושי, בקביעת הפונקציה של גורמים גנטיים בהפעלת או שיכוך תגובות חיסוניות3,4. חשוב לציין כי מערכת החיסון של היונקים היא הטרוגנית מאוד, ולא פחות חשוב, מספר עצום של מולקולות לשלוט בידול, הגירה, ותפקוד של תא נתון סוג5,6.

מקובצים באופן קבוע בין-מרחבים קצר פלינדרומי חוזרים (CRISPR)/Cas9 כלי עריכת גנום המאפשרים מניפולציה גנטית של סוגי תאים ספציפיים, המאפשר ביאור תפקודי של גנים בצורה מדויקת7,8. מספר פרוטוקולים שפורסמו תיארו את המסירה של CRISPR/Cas9 בצורה של מתחמי RNA של Cas9-guide המכונים ריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) בתאי HEK293, קווי תאים של Jurkat, תאי T ראשיים9,10, מקרופאגים11,12,13, תאי גזע14, ואחרים15,16. בפרוטוקולים אלה, תיוג גנים מושגת בדרך כלל על ידי היתוך תג פלואורסצנטי לחלבונים אנדוגניים17,18. עם זאת, נעשו ניסיונות מעטים להשתמש בכתבים פלואורסצנטיים כפולים, התואמים למיון תאים בודדים, כדי להקל על ניסויי נוק-אין19,20, במיוחד בתאי מערכת החיסון.

ניתוחים מכניסטיים מעמיקים שמטרתם להבין את תפקודו של גורם גנטי חדשני בתאי החיסון דורשים בדרך כלל מחיקה ספציפית מסוג תאים של גן, ניסויי הצלה גנטיים וזיהוי אידיאלי של האינטראקטיבים שלו. למרות שיטות לאופטימיזציה של מחיקה גנטית של גנים בתאי מערכת החיסוןפורסמו 9,15,21, הרבה פחות שיטות דווחו עבור החדרת אללים knock-in עם פונקציות מגוונות כדי להבין את התגובה החיסונית. לכן, בפרוטוקול זה אנו שואפים לתאר בפירוט פרוטוקול יעיל מאוד לשחזור כדי להביע חלבון של עניין (POI) על locus הנמל הבטוח Rosa26 הן בקווי תאי החיסון האנושיים והן מורין. עיצבנו מערכת כתבים בשני צבעים כדי להעשיר עבור תאים שהודבקו בפלסמידים המבטאים CRISPR/Cas9 (DsRed2) ותבנית דנ"א רקומביננטית (EBFP2), שניתן לבודד על ידי מיון תאים. בעקבות פרוטוקול זה, השגנו שורות נוק-אין מרובות של קו תא T האנושי Jurkat ו מקרופאגים מורין RAW264.7 עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים שנחקרו בצורה גרועה.

כדוגמה, אנו מראים בפרוטוקול זה כיצד להשיג נוק-אין RAW264.7 מקרופאגים מבטאים ביציבות ACE2 אנושי (קולטן של SARS-Cov-2)22. מכיוון שתאי חיסון מולדים מעורבים בפתוגנזה של Covid-1923,24 ו- ACE2 האנושי נחשב לקולטן מרכזי הנדרש לכניסה ויראלית לתאים לפני השכפול, מקרופאגים עם נוק-אין של ACE2 האנושי יכולים לשמש ככלי שימושי למחקרים מכניים של כפל ויראלי בתוך מקרופאגים. במקביל, אנו מציגים גם דוגמה של נוק-אין של גן על locus ROSA26 האנושי להביע את חלבון RASGRP1, אשר הותך במינוח האמינו שלה עם זיקה טווין-סטרפטופט -תג (OST). תאי T הם תאי יעד מרכזיים לטיפולים במערכת החיסון, ומספר גדל והולך של מחקרים התמקדו במניפולציה של התגובה שלהם לסרטן25,26. כמו Rasgrp1 ידוע להיות מולקולת איתות מפתח במורד הזרם של קולטן תא T ואת interactors שלה אינם מנוכרים היטב27, מודל OST-RASGRP1 knock-in מספק את הבסיס לזיהוי אינטראקציות המסדיר את התגובה של תאי T לגידולים וזיהום. יחד, כלים אלה יכולים לשמש למחקרי Covid-19 וגילוי של מולקולות חדשניות אינטראקציה עם Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב ופלסטיד בניית sgRNAs מיקוד Rosa26 לוקוס

  1. RNAs של מדריך עיצוב סביב אתר ההוספה הרצוי
    1. ודא כי אתר ההחדרה עבור העכבר Rosa26 (להלן מוגדר mRosa26) ניסויי נוק-אין ממוקם אינטרון הראשון של mRosa26; אתר זה שימש במחקרים קודמים28,29. לניסויים נוק-אין בתאים אנושיים, ודאו כי אתר ההחדרה שוכן בלוקוס ROSA26 האנושי (להלן hROSA26), שזוהה כהומולוג האנושי של mRosa2630.
    2. השתמש ברצפים הגנומיים של עכבר ומינים אנושיים המתקבלים מ- Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) ודפדפן הגנום אנסמבל (http://www.ensembl.org/index.html), בהתאמה. העתק 50 זוגות בסיס (bp) של הרצף הגנומי של הלוקוס mRosa26 או hROSA26 בכל צד המאגף את אתר הכניסה הרצוי.
    3. מדריך העיצוב RNAs באמצעות כלי האינטרנט המקוון CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. הדבק את רצף הקלט של 100 bp מ- 1.1.2. בחר שני RNAs של מדריך עם ציון ייחודיות גבוה, ציון יעילות גבוהה ופעילות נמוכה מחוץ ליעד. בנוסף, בחר מדריכי RNA עם ציונים גבוהים יותר Doench ולהימנע מאלה המסומנים כמו "לא יעיל"32.
      הערה: כלי עיצוב חלופיים CRISPR הם גם בעלי ערך וזמינים לציבור, למשל כלי העיצוב BENCHling CRISPR (https://benchling.com/crispr). כדי להגדיל את התדירות של תאים שעברו מוטציה בתיווך CRISPR/Cas9, בחר שני RNAs של מנחים קרוב לאתר הכניסה הרצוי כאשר הדבר אפשרי33.
    4. עבור לוקוס mRosa26, השתמש בשני מדריך סמוך RNAs המיועדים mR26-sg1 (5 '- CTCCAGTCTCTCTCTAGAAGAT -3') ו- mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTCTCTCTAGAAAGAC -3')(איור 1A). עבור לוקוס hROSA26, השתמש בשני מדריך סמוך RNAs, כלומר hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACG -3') ו hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3')(איור 1B).
      הערה: פעילויות עריכת הגנום של mR26-sg1 ו- mR26-sg2 ואלה של hR26-sg1 ו- hR26-sg2 הוערכו בתאי RAW264.7 ותאי Jurkat, בהתאמה (ראה קובץ משלים, איור S1).
  2. שיבוט של וקטורים של ביטוי CRISPR המכילים sgRNA המתמקדים בלוקוס Rosa26
    1. לסנתז אוליגוס קדימה ואחורה עבור RNA מדריך אחד (ראה קובץ משלים).
      הערה: עדיף להוסיף נוקלאוטיד 'G' לתחילת רצף המדריכים, המסייע בביטוי המונע על ידי מקדם U6. לדוגמה, כדי לשכפל את mR26-sg1 הנ"ל, אוליגו קדימה הוא CACCGCTCCAGTCTCTCTAGAAGAT ואת אוליגו הפוך הוא AAACATCTCTAGAAAGACTGGAGC. G נוסף באוליגו הקדמי והמשלים שלו באוליגו ההפוך מסומנים באומץ.
    2. שכפול אוליגוס סינתטי המתאים למדריך RNAs לווקטור הביטוי CRISPR all-in-One pX458-DsRed2 שנוצר בעבודה הקודמת שלנו21 (איור 1C) באמצעות הפרוטוקול הכללי לשיבוט gRNA שפותח על ידי המעבדה של ג'אנג (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); עם זאת, לדלג על שלב טיהור הג'ל ולטהר את הווקטור המעוכל באמצעות ערכת טיהור PCR (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: בפרוטוקולים קודמים בוצע טיהור ג'ל של הווקטור מתעכל BbsI; עם זאת, שלב זה גוזל זמן רב. בפרוטוקול הנוכחי, המוצר המעוכל מטוהר באמצעות ערכת טיהור PCR ומשמש ישירות לתגובת קשירת במורד הזרם, אשר בדרך כלל מייצר מושבות חיוביות עם יעילות דומה.
    3. להפוך 10 μL של מוצר קשירה (שלב 1.2.2) לתוך 50 μLשל Escherichia coli DH5α תאים מוסמכים על פי הוראות היצרן. בחר באופן אקראי שלוש מושבות מצלחת אגר LB עם אמפצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ולחסן כל אחד לתוך 3 מ"ל של מדיום LB עם אמפצילין עבור culturing בן לילה.
    4. השתמש 1 מ"ל של תרבות חיידקים לילה עבור רצף סנגר ולשמור על השאר ב 4 °C (75 °F) עד המבנה מאושר להיות נכון: pDsR-mR26-sg1 ו pDsR-mR26-sg2 עבור mRosa26 לוקוס לדפוק ב, ו pDsR-hR26-sg1 ו pDsR-hR26-sg2 עבור לוקוס hROSA26.
    5. הכן ריכוז גבוה של DNA plasmid (כ 2 מיקרוגרם / μL) עם ערכת maxiprep לטיהור של plasmid כיתה transfection (ראה טבלה של חומרים).

2. תכנון ובניית וקטורים פילוח כתבניות רקומבינציה הומולוגיות

  1. עיצוב תבנית תיקון מונחית הומולוגיה
    1. עצבו וקטור פילוח שיבטא את ה-POI באמצעות קלטת ביטוי הממוטבת ממחקר קודם29, הכולל מקדם היברידי CAG, אתר הגבלת AscI המאפשר שיבוט של ה- CDNA של POI, כתב IRES-EBFP2, ואות פוליאדנילציה של הורמון גדילה בקר (bGH-polyA) (איור 1B וקובץ משלים).
    2. עיצוב זרועות ההומולוגיה (HAs) החולקות את ההומולוגיה עם הרצפים הגנומיים של הלוקוס mRosa26 או hROSA26. כלול כ- 1 kb של 5' HA המתאים לרצף הגנומי במעלה הזרם מאתר הכניסה הרצוי משמאל לקלטת הביטוי. באופן דומה, כלול כ- 1 kb של 3' HA המתאים לרצף הגנומי במורד הזרם מאתר הכניסה מימין לקלטת הביטוי.
      הערה: קלטת הביטוי נוספת קרוב ככל האפשר לאתרי המחשוף CRISPR/Cas934. כדי להימנע מחיתוך מחדש של אלל ממוקד על ידי CRISPR/Cas9, לשלב שינויים נוקלאוטיד לתוך רצף המוטיב הסמוך protospacer (PAM) (5'-NGG-3') בווקטור פילוח34,35.
    3. כדי לאפשר ליניאריזציה של וקטור הפילוח, הכנס אתר EcoRI ייחודי במעלה הזרם של 5 ' HA ואתר BamHI ייחודי ממש במורד הזרם של 3 'HA.
    4. יש ספק מסחרי לסנתז את וקטורי פילוח ולייעד אותם כמו pKR26-iBFP ו pKhR26-iBFP עבור mRosa26 ו- hROSA26 knock-in, בהתאמה.
  2. בניית וקטור פילוח כתבנית תיקון מונחית ההומולוגיה
    1. כדי לבטא את POI, להשיג את רצף cDNA (רצף קידוד) מדפדפן הגנום אנסמבל ולבחור את התמליל בעל רצף החלבון הארוך ביותר. לדוגמה, ה- cDNA של הגן האנושי ACE2 הוא ACE2-202 ENST00000427411.2 וה- cDNA של גן RASGRP1 האנושי הוא RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. לסנתז את cDNA של POI בעזרת ספק מסחרי. ניתן גם לשכפל את ה- cDNA באמצעות הגברת PCR (לא מתואר כאן). מקם את הרצף GGCGCGCCACC (5' - 3'), הכולל אתר הגבלת AscI (נוי ונועז) ואתר ייזום התרגום בקונצנזוס Kozak (הדגיש), מיד לפני קודון החניכה ATG של cDNA ואתר הגבלת AscI אחר (5'- GGCGCGCC -3') לאחר קודון העצירה של cDNA.
    3. לעכל את הרצף מסונתז עם AscI ולטהר באמצעות ערכת טיהור PCR המיועדת לטיהור שברי DNA לאחר הגבלת העיכול, בעקבות הוראות היצרנים (ראה טבלת חומרים).
    4. ליגת את ה-cDNA המטוהר לתוך וקטור עמוד השדרה הליניארי pKR26-iBFP או pKhR26-iBFP באמצעות ligase DNA T4 בעקבות הוראות היצרן.
    5. אמת את וקטור הפילוח הסופי, pKR26-POI-iBFP או pKhR26-POI-iBFP, על-ידי רצף. השתמש maxiprep כדי לטהר את המבנים המאומתים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    6. לעכל את וקטור פילוח באמצעות EcoRI או BamHI ולטהר את מוצר העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR על פי הוראות היצרן. אחסן את וקטור הפילוח הליניארי (~ 0.8 מיקרוגרם / μL) ב - 20 °C עד אלקטרופורציה.

3. אלקטרופורציה של קווי מקרופאג' ותאי T

  1. הכנת תרביות תאים לאלקטרופורציה
    1. הכן רוזוול פארק ממוריאל המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) כאמצעי צמיחה מלא עבור תאי Jurkat T. הכן את מדיום הנשר המעודכן (DMEM) של דולבק עם 10% FBS עבור פולחן RAW264.7 מקרופאגים. להשלים את כל מדיה צמיחה מלאה עם פניצילין U /mL ו 100 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין (Pen/ Strep) למעט מדיה המשמשת דגירה לאחר transfection לפני מיון התא.
    2. בצע תת-תרבות של תאי RAW264.7 ו- Jurkat T בהתאם להוראות הספק (ראה טבלת חומרים). בעת תת-תרבות RAW264.7 תאים, השתמש בפתרון טריפסין-EDTA (0.25%) כדי לנתק תאים. השתמש FBS בתוספת עם 10% (v/v) DMSO כאמצעי שימור הקפאה עבור RAW264.7 ותאי Jurkat.
    3. לאסוף תאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות עבור RAW264.7 מקרופאגים ו 90 × גרם במשך 8 דקות עבור תאי Jurkat T. לאחר מכן לשטוף עם 5-10 מ"ל של 1× DPBS (ללא Ca2 + או מ"ג2 + יונים). הסר את ה- DPBS.
    4. resuspend גלולה התא באמצעות 2 מ"ל של 1× DPBS. השתמש 10 μL של תאים לערבב עם נפח שווה של 0.2% טריפן כחול כדי להעריך את ספירת התאים ואת הכדאיות.
      הערה: ודא שתרבית התאים >90% הכדאיות ביום ההדבקה.
    5. לניסוי נוק-אין יחיד, בצע אלקטרופורציה עם 10 טיפים נוקלאופקטיון μL עם חמש חזרות. חשב את הנפח הדרוש עבור 2.0 × 106 תאים ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה. לשטוף את הכדור התא שוב עם 1× DPBS כמתואר בשלב 3.1.3.
      הערה: בעת שימוש 10 טיפים נוקלאופקטיון μL, 4.0 × 105 תאים נדרשים לכל אלקטרופורציה. בהתאם, להכין לפחות 2.0 × 106 תאים לניסוי נוק-אין אחד.
    6. הכן צלחת 24-well עם 0.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלא (מוכן בשלב 3.1.1) לבאר ללא עט / סטרפטוקום וקדם-מלחמה בחממה 37 °C.
  2. אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR/Cas9 וקטור הפילוח
    1. הפעל את מערכת האלקטרופורציה. השתמש בפרמטרים אלקטרופורציה ממוטב במחקר הקודם21: 1,400 V / 20 ms/ 2 פולסים עבור RAW264.7 מקרופאגים ו 1350 V / 20 ms/ 2 פולסים עבור תאי Jurkat T.
    2. חשבונאות לאובדן מדגם עקב pipetting, להכין תערובת אלקטרופורציה 55 μL בצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל המכיל 2.5 מיקרוגרם של כל וקטור CRISPR / Cas9, 2.4 מיקרוגרם של וקטור פילוח ליניארי, ואת חוצץ Resuspension R.
      הערה: כדי לחסוך זמן, תערובת אלקטרופורציה ניתן להכין במהלך צנטריפוגה (שלב 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 תאים (מוכן בשלב 3.1.5) בתערובת אלקטרופורציה 55 μL בשלב 3.2.2.
    4. שאפו את תערובת התא/אלקטרופורציה לשלב 3.2.3 באמצעות קצה נוקלאופקטיון 10 μL עם פיפטה.
      הערה: במהלך pipetting, להימנע החדרת בועות אוויר, אשר עלול לגרום לכשל אלקטרופורציה.
    5. הוסף את הדגימה לצינור מלא 3 מ"ל של Buffer E מערכת אלקטרופורציה.
    6. החל את הפרמטרים אלקטרופורציה עבור שני סוגי התאים כמתואר בשלב 3.2.1.
    7. מעבירים את הדגימה לבאר אחת של צלחת 24-well עם מדיום מחמם מראש מהשלב 3.1.6.
    8. חזור על שלבים 3.2.4-3.2.7 עבור ארבע החזרות האחרות, כמו גם עבור וקטור הפילוח בלבד ופקדי וקטור הביטוי CRISPR בלבד.
      הערה: שנה את קצה הנוקלאופקט ואת הצינור בעת מעבר לסוג תא אחר / DNA פלסמיד.
    9. תרבית התאים transfected עבור 48-72 שעות כדי לאפשר התאוששות לאחר אלקטרופורציה וביטוי של רכיבי CRISPR / Cas9 לפני ניתוח ציטומטריה זרימה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבחון את הביטוי של DsRed2 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד בערוץ אדום ב 24 שעות לאחר transfection.
      הערה: יתרון של ניטור תאי פלורסנט DsRed2 הוא כי היעילות של אלקטרופורציה ניתן להעריך את ההתאמה למיון תאים נוספים ניתן לחזות.

4. מיון תאים כדי לבודד תאים מכניסים

  1. לפני מיון FACS, לשטוף את התאים transfected פעם אחת עם מדיום צמיחה מלא. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 3.1.3 ו resuspened הכדור ב 500 μL של מדיום טרי.
  2. הגדר את סדרן התאים (הממוקם בארון בטיחות ביולוגית) עם זרבובית 85 מיקרומטר וקצב זרימה נמוך. בחר את מצב "תא בודד" למיון ובדיקת היעילות והדיוק של מיון תאים בודדים על-ידי מיון 20-30 תאים לכיסוי של מיקרו-לוחית 96-well. טיפה אחת המותאמת לשפות מקומיות במרכז כל באר מציינת התקנה נכונה של המכשיר.
  3. העבר את מתלה התא מ שלב 4.1 לצינורות FACS סטריליים והוסף כתם תא מת אדום SYTOX לריכוז סופי של 1 ננומטר.
  4. נתח דוגמאות בממיין התאים. SYTOX Red ו- EBFP2 נרגשים מלייזר 405 ננומטר ומזוהים על ידי ערוצי V450/BV421 ו- APC, בהתאמה. DsRed2 מתרגש על ידי לייזר 488 ננומטר ומזוהה על ידי ערוץ PE. השתמש בתאים שאינם מהודבקים ובתאים חיוביים יחידים של EBFP2 ו- DsRed2 כפקדים לפיצוי ספקטרלי.
  5. מיין 10 תאים בודדים לתוך כל באר של מיקרו-לוחית בעלת 96 באר המכילה 150 מיקרו-אל לבאר של מדיום צמיחה מלא שהתחמם מראש. השתמש במיקרו-לוחות עגולים לקווי תאי השעיה פולחניים כגון תאי Jurkat T ומיקרו-לוחות תחתוניים שטוחים עבור מקרופאגים גולמיים חסידים RAW264.7.
    הערה: מיון של 10 תאים לבאר היא אסטרטגיה ממוטבת לשיפור הישרדות התאים ולמזעור מספר המיקרו-לוחות של 96-well שיש לזרוע ומספר הדגימות שצריכות להיות מוקרנות על ידי ציטומטריית זרימה וגנוטיפינג; אם מיון תא אחד בלבד לבאר, זריעה של יותר microplates נדרש כדי להגדיל את הסיכוי להשיג תאים ערוכים כראוי.

5. סינון ואימות של תאים חיוביים

  1. הקרנה עבור תאי נוק-אין מועמדים לפי ציטומטריית זרימה
    1. לדגור על התאים בשלב 4.5 במשך 10-15 ימים ולהוסיף מדיום צמיחה מלא כל 3 ימים כדי להחליף נוזל שאבד באמצעות אידוי. עבור תאי Jurkat T, העבר תאים הגדלים בלוח התחתון העגול 96-well ללוח תחתון שטוח כדי לייעל את התפשטות התאים.
    2. העבר את התאים ממוינים מורחבים ללוחות 48 בארות להרחבה נוספת.
    3. כאשר התאים קרובים למפגש, השתמש במחצית מהתרבות כדי לסנן את ביטוי EBFP2 לפי ציטומטריית זרימה (איור 3). בדרך כלל, מחצית התרבות בצלחת 48-well לאחר צמיחה confluent משווה 0.5-1.0 × 105 תאים, אשר מספיק לניתוח של מדגם אחד על ידי ציטומטריית זרימה.
    4. מעבירים את התאים הנותרים לצלחות של 24 בארות להתפשטות נוספת.
    5. שמור על אוכלוסיות התא המועמדים בעלי אחוז גבוה של תאים חיוביים EBFP2 לניסויים genotyping נוסף.
      הערה: מכיוון ש-10 תאים ממוינים לכל באר של המיקרו-לוח בן 96 הבאר, ייתכן שתאי הנוק-אין יגדלו עם תאים שאינם מבטאים את הגן. לכן, זה נורמלי לבצע סיבוב נוסף של מיון תאים כדי להפריד את התאים EBFP2 חיוביים מהתאים השליליים.
  2. הקרנה עבור תאי נוק-אין של מועמדים לפי PCR ורצף
    1. לאסוף 2 × 105 תאים מועמדים. לחלץ את ה- DNA הגנומי באמצעות ערכת הכנה DNA (ראה טבלה של חומרים).
    2. כדי לוודא שתיקון מדויק מונחה ההומולוגיה (HDR) התרחש בלוקוס mRosa26 ולא באתרים אקראיים בגנום של תאי הנוק-אין של המועמד, בצעו PCR עם פריימרים המשתרעים על פני כל צד של ה- HAs (איור 4). בחר פריימר אחד הממוקם באזור הגנומי מחוץ לווקטור המטרה (אוליגו חיצוני) ועוד פריימר הממוקם בתוך וקטור המטרה (אוליגו פנימי).
      הערה: עיצוב דומה משמש לאימות HDR בלוקוס hROSA26. פריימרים PCR יכול גם להיות מתוכנן בקלות לזיהוי החדרת רצף POI. בנוסף, ניתן לזהות בו זמנית את הגנוטיפים של allele מסוג פראי ונוק-אין באמצעות פי.סי.אר בעל שלושה פריימרים (ראה קובץ משלים, איור S2).
    3. שכפל את מוצרי ה- PCR החיוביים באמצעות ערכת שיבוט מהיר (ראה טבלת חומרים). להפוך את תערובת התגובה לתאים DH5α מוסמכים.
    4. בחר באופן אקראי 8-10 מושבות חיידקים בודדות לכל טרנספורמציה ורצף את מוצרי ה- PCR מהשלב 5.2.3 על ידי רצף סנגר.
  3. אימות של תאי נוק-אין חיוביים על ידי ניתוח חיסוני וטיהור זיקה
    הערה: תאים מועמדים נתונים לניתוח אימונובלוט לאימות החדרת POI, או טיהור זיקה (AP) למחקרים של אינטראקציה חלבון חלבון.
    1. בצע ניתוח אימונובלט בהתאם להוראות יצרן הנוגדנים. ראה טבלת חומרים לקבלת מידע אודות השימוש בנוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים.
    2. נתקוף את lysates של תאי knock-in מבטאים את POI מתויג OST ל- AP באמצעות חרוזי סטרפטין Sepharose בעקבות הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
    3. זהה כימותרפיה באמצעות צלם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל לביצוע ניסויי נוק-אין בלוקוס mRosa26 באמצעות מקרופאגים RAW264.7 murine, עיצבנו וקטור מיקוד כדי לבטא ACE2 אנושי, קולטן עבור וירוס SARS-Cov-2 (איור 2A). באמצעות עיצוב דומה, יצרנו תאי Jurkat T אנושיים עם נוק-אין של חלבון היתוך RASGRP1 מתויג OST(איור 2C). לאחר החלפה של שלושה פלסמידים, שניים מהם שימשו לביטוי של CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 ו- pDsR-mR26-sg2 עבור mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 ו- pDsR-hR26-sg2 עבור הנוק-אין hROSA26) ועוד אחד המשמש כתבנית DNA לשילוב הומולוגי (EBFP2), תאים חיוביים כפולים המבטאים שני כתבים פלואורסצנטיים מוינו ללוחית 96-well. מתוך תאי RAW264.7 ממוינים באמצעות מצב מיון תא בודד, 0.91% היו DsRed2+ EBFP2+, אך 10 תאים נאספו לכל באר(איור 2B). לתאי Jurkat T הייתה יעילות טרנס-זיהום גבוהה יותר, ואחוז התאים החיוביים הכפולים היה 7.91% בניסוי מייצג זה, והדגים נוק-אין מוצלח של חלבון ההיתוך OST-RASGRP1(איור 2D).

בשלב הבא, ציטומטריית זרימה שימשה לסנן עבור בארות המועמד עם תאים חיוביים EBFP2. היסטוגרמה מייצגת הראתה כי היו אוכלוסיות חיוביות EBFP2 ברורות(איור 3). ראוי לציין כי תאי הנוק-אין לא הביעו DsRed2 כאשר ציטומטריית הזרימה בוצעה שבועיים לאחר מיון התא.

לאפליה של דפיקות מדויקות והוספות אקראיות, DNA גנומי מהתאים החיוביים ל- EBFP2 נבדק עוד יותר על ידי ביצוע PCR עם פריימרים המזהים רצף גנומי חיצוני ל- HAs של וקטור הפילוח והאזור הספציפי בתוך קלטת הביטוי (איור 4A ו- 4B). ניתוח רצף של מוצרי PCR אלה אישר את התרחשות HDR באתר היעד mRosa26 (איור 4C). אותה אסטרטגיית genotyping ניתן להחיל כדי לאמת את ההוספה המדויקת של קלטת הביטוי בלוקוסhROSA26 של תאי Jurkat T.

כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי RAW264.7 המביעים hACE2, מיינו עוד יותר את התאים ואימתנו את נוכחותם של הכתבים הפלואורסצנטיים בעקבות התרחבות באמצעות תאים מסוג בר כפקדים (איור 5A). התאים המורחבים היו חיוביים ל-EBFP2, וחלבון hACE2 ניתן לזיהוי בקלות במקרופגים גולמיים(איור 5B ו-5C). באופן דומה, אימתנו את הביטוי של כתבים פלואורסצנטיים ואת חלבון OST-RASGRP1 בתאי Jurkat T אנושיים לאחר ההקרנה וסבב שני של מיון תאים (איור 6A ו- 6B). בנוסף, טיהור זיקה של חלבון OST-RASGRP1 בוצע באמצעות חרוזים זמינים מסחרית. מצאנו כמות גבוהה יותר של חלבון RASGRP1 בסך הכל תאי lysates של דפיקות בתאי Jurkat מאשר אלה של תאים מסוג בר; תאי ג'וrkat בנוקאאוט RASGRP1 שימשו כפקדים(איור 6C). לאחר הטיהור באמצעות תג OST, רק דגימות knock-in היה לגילוי RASGRP1 (איור 6D).

Figure 1
איור 1. אסטרטגיית פילוח גנים ליצירת קווי תאים מסוג mRosa26/hROSA26 המבטאים יתר על המידה חלבון בעל עניין. (A) mRosa26- רצפי פילוח RNA מדריך ספציפי ומוטיבים סמוכים protospacer (PAMs) באתר הכניסה הרצוי מסומנים באותיות כחולות ואדומות, בהתאמה. Cas9 בדרך כלל בקע 3-4 bp במעלה הזרם של רצף PAM, אשר מצוין על-ידי חצים ירוקים. וקטור הפילוח משמש כתבנית לתיקון מונחה ההומולוגיה (HDR) המוביל להכנסה מדויקת של קלטת הביטוי בעכבר או בגנום האנושי. כל אחד מהרצפים של 1 kb במעלה ובמורד הזרם של אתר היעד הרצוי משמש כזרועות ההומולוגיה של 5' ו- 3 ' (HAs) בווקטור המטרה. ה- HAs מופרדים על ידי קלטת ביטוי המורכבת ממקדם CAG, רצף ה- cDNA של חלבון העניין (POI) עם תג OST, כתב IRES-EBFP2 ואות bGH-polyA (pA). אתר ההגבלה AscI משמש לשיבוט POI, ו- EcoRI ו- BamHI משמשים ליניאריזציה של וקטור הפילוח. האסטרטגיה עבור נוק-אין בתיווך CRISPR/Cas9 בלוקוס hROSA26 דומה. (ב) תרשים של לוקוס ROSA26 האנושי. רצפי הפילוח hR26-sg1 ו- hR26-sg2 מסומנים באותיות כחולות ורצפי PAM המתאימים באדום. (ג) סכמטי עבור וקטור הביטוי CRISPR all-in-one pX458-DsRed2, המכיל קלטת ביטוי SgRNA אנושית מונחית U6 וקלטת כתב פלואורסצנטית Cas9-T2A-DsRed2. שני אתרי הגבלת BbsI מאפשרים שיבוט של RNA המדריך. U6, מקדם פולימראז RNA RNA אנושי; sgRNA, RNA כימרי בעל מדריך יחיד; CBh, מקדם היברידי β-אקטין; NLS, אות לוקליזציה גרעינית; T2A, וירוס תיאה אסיגנה 2A פפטיד שיתוף עצמי; bGH-pA, אות פוליאדנילציה הורמון גדילה בקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. מיון תאים בודדים של תאי RAW264.7 ו- Jurkat שהודבקו בווקטורים CRISPR/Cas9 וקטורים מיקוד לרקומבינציה הומולוגית. וקטורים מיקוד המשמשים ביטוי גנים יציב RAW264.7 (A) ותאי Jurkat (C).  חלקות ציטומטריות זרימה מייצגות של עכבר RAW264.7 מקרופאגים (B) ותאי Jurkat T אנושיים (D) שהודבקו בווקטורים CRISPR/Cas9 המבטאים את כתב DsRed2 ואת וקטור הפילוח המבטא את כתב EBFP2. תאים המביעים במשותף DsRed2 ו- EBFP2 היו נתונים למיון תאים ותרביתות להתרחבות; מספרים הצמודים לאזורים המסווגים בקו לרמות מציינים את אחוז התאים בכל שער, ותאים שאינם שהודבקו שימשו כפקד שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. סינון של תאים מונקים על-ידי זיהוי ביטוי EBFP2. ניתוח ציטומטרי זרימה של EBFP2+ ו- DsRed2+ RAW264.7 מקרופאגים (A) ותאי Jurkat T (B) 14 ימים לאחר אלקטרופורציה. בהיסטוגרמה, עוצמת הפלואורסצנטיות (FI) של תאים EBFP2+ או DsRed2+ מוצגת בציר X וספירת האירועים בכל ערוץ פלואורסצנטי מוצגת בציר ה- Y. (א) הביטוי של EBFP2 ו- hACE2 הונע על ידי אותו מקדם בלוקוס Rosa26 במקרופגים גולמיים 264.7. (B) בתאי Jurkat, ביטוי OST-RASGRP1 מקושר לביטוי EBFP2 בלוקוס ROSA26 האנושי. ב 14 ימים לאחר אלקטרופורציה, ניתוח ציטומטרי זרימה גילה כמעט אפס DsRed2+ תאים בין התאים ממוינים. תאים מסוג פראי (WT) שימשו כשליטה שלילית, ו- KI מייצג תאים נוק-אין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. הקרנה עבור תאי נוק-אין של מועמדים לפי PCR ורצף. (A) אסטרטגיה ליצירת תאי נוק-אין hACE2. מיקומי פריימרי PCR המשמשים להבחנה בין HDR מדויק לבין הוספה אקראית מסומנים על-ידי חצים ירוקים. (B) גנוטיפינג PCR של חמישה תאים מועמדים (#4, #15, #22, #25 ו- #43) שזוהו על ידי הקרנת ציטומטריית זרימה עבור ביטוי EBFP2 כפי שמודגם באיור 3, הראה כי הן צומת 5 ' (1472 bp) והן צומת 3 ' (1472 bp) המשתרע על זרועות ההומולוגיה היו נכונים. M, סולם DNA; WT, פקד RAW264.7 מסוג פראי; H2O, שליטה שלילית. (ג) רצף סנגר של מוצרי PCR מ- B חשף דפיקה מוצלחת של קלטת hACE2-expression לתוך הלוקוס mRosa26 ללא מוטציות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. אימות של נוק-אין מוצלח של קלטת הביטוי hACE2 לתוך הלוקוס mRosa26 במקרופצים RAW264.7. (A) מקרופאגים WT RAW264.7 שימשו כשליטה שלילית לניתוח ציטומטרי של זרימה. (B) כדי להפריד את התאים החיוביים EBFP2 מהתאים השליליים, בוצע סבב נוסף של מיון תאים כדי להשיג אוכלוסייה המורכבת כמעט 100% EBFP2+ תאים knock-in, המיועדים כתאי hACE2 KI. ביטוי DsRed2 נבדק גם כדי להבטיח כי CRISPR / Cas9 plasmid לא היה משולב בגנום של מקרופאגים RAW264.7. בהיסטוגרמות, עוצמת הפלואורסצנטיות (FI) של EBFP2+ או DsRed2+ תאים מוצגת בציר X ומספר האירועים בכל ערוץ פלואורסצנטי מוצג בציר ה- Y. (ג) זיהוי של ביטוי hACE2 על ידי ניתוח אימונובלט באמצעות נוגדן חד שבטי ACE2 אנטי אנושי ארנב. ביטוי של hACE2 נצפה בתאים מבארות מרובות (#4, #15, #22, #25 ו- #43). מקרופאגים WT RAW264.7 שימשו כפקד שלילי ו- GAPDH שימש כפקד הטעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. אימות של נוק-אין מוצלח של קלטת הביטוי OST-RASGRP1 לתוך לוקוס hROSA26 בתאי Jurkat T. (A) תאי WT Jurkat T שימשו כשליטה שלילית לניתוח ציטומטרי זרימה. (ב) EBPF2+ אוכלוסין של תאי Jurkat הועשרו על ידי סבבים נוספים של מיון תאים והורחבו; תאים אלה הוגדרו כתאי OST-RASGRP1 KI. תאי הנוק-אין נותחו על ידי ציטומטריית זרימה ולא שמרו על וקטור הבעת DsRed2. בהיסטוגרמה, עוצמת הפלואורסצנטיות (FI) של תאים EBFP2+ או DsRed2+ מוצגת בציר X וספירת האירועים בכל ערוץ פלואורסצנטי מוצגת בציר ה- Y. (ג) זיהוי של ביטוי OST-RASGRP1 בשני תאים עצמאיים (#1 ו- #2) על ידי ניתוח אימונובלט באמצעות נוגדן נגד RASGRP1. WT Jurkat ו RASGRP1-נוקאאוט Jurkat תאים שימשו פקדים β-actin שימש כבקרת הטעינה. (D) טיהור זיקה בתיווך OST שימש לאימות הביטוי של OST-RASGRP1 באמצעות תאי נוקאאוט RASGRP1 כפקד שלילי. ניתוח אימונובלט של כמויות שוות של חלבונים מ- lysates התאים שהיו נתונים לטיהור זיקה על חרוזי סטרפטוקוין Sepharose (טיהור זיקה) או מנותח ישירות (סך ליזטים) ונבדק עם נוגדני RASGRP1 או GAPDH (בקרת טעינה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים: דמויות תומכות, טבלה ורצפים אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניסויים שלנו, הדגמנו כיצד לבצע עריכה נוק-אין בתאי מערכת החיסון מעיצוב מבנים ועד הקרנת תאים ואימות באמצעות תאי Jurkat T אנושיים ו macrophages RAW264.7 murine כדוגמאות. הן קווי תא T והן קווי תא מקרופאג' עמידים בפני טרנספקטיון36,37; עם זאת, הבעיה של יעילות נמוכה של משלוח CRISPR / Cas9 ניתן להתגבר בעזרת כתבים פלואורסצנטיים יחד עם מיון תאים. פרוטוקול זה מתאים לניסויים להצלת גנים וניסויים באינטראקציה בין חלבון חלבון, אך לא ניתן ליישם אותו על חקר רצפי דנ"א רגולטוריים כגון אתרים מחייבים של גורמי שעתוק מכיוון שהפוטוקול פותח לשינוי נוק-אין של הלוקוס Rosa26.

כתבים פלואורסצנטיים כפולים סייעו לעריכת נוק-אין CRISPR/Cas9
יישמנו בהצלחה מערכת עיתונאי פלואורסצנטית כפולה כדי לבטא באופן ארעי סטים עצמאיים של וקטורים CRISPR/Cas9 בתאי מערכת החיסון, מה שגרם למחיקת שברי DNA גדולים במחקרים קודמים21. עיצבנו כלי פילוח CRISPR/Cas9 באמצעות חלבון הפלואורסצנטי DsRed2 ככתב וחלבון פלואורסצנטי ייחודי ספקטרלי נוסף כדי לעקוב אחר אספקת תבנית ה- DNA לשינוי נוק-אין. כדי להפוך את שינוי allele נוק-אין אפשרי, השתמשנו בכתב חלבון פלואורסצנטי EBFP2, אשר אין דליפה ספקטרלית עם RFP (DsRed2 במקרה שלנו), כדי לפקח על transfection של ה- DNA התורם המשמש כתבנית במהלך recombination הומולוגי. כדי לייעל את הקלטת המבטאת את POI וכתב פלואורסצנטי, רצף IRES הוצג כדי להשיג חלבונים עצמאיים. במחקר הקודם שלנו, ציינו כי שאריות חומצות אמינו מן המקשר P2A או T2A שנותר לאחר מחשוף לאחר שעתוק השפיעו על לוקליזציה חלבון על פני התא. רצף IRES אינו משאיר חומצות אמינו שיורית כאלה. כפי שתואר במחקר קודם, IRES הוליד רמות גבוהות יותר של הכתב הפלואורסצנטי, בעקבות ביטוי של חלבון Cas9 מונע על ידי מקדם CAG38.

כל אחד CRISPR/Cas9 פלסמיד
פורמטים שונים ושילובים של מערכת CRISPR/Cas9 תוארו במחקרים קודמים, כגון טרנספקטציה Cas9 כ- mRNA או חלבון יחד עם sgRNAs39מסונתז כימית . מתחמי CRISPR/Cas9 RNP הועברו גם לתאי יונקים; אסטרטגיה זו מציעה את היתרונות של גרסה מוקדמת יותר של פעילות נוקלאז ומחצית חיים קצרה יותר; עם זאת, תיוג RNPs הוא פחות חסכוני בהשוואה לבניית פלסמיד All-in-One. במחקרים הקודמים שלנו, מצאנו כי באמצעות מיון תאים בודדים כדי לבודד את אותם תאים נדירים המבטאים CRISPR/Cas9 (DsRed2 חיובי) ואת חלבון נוק-אין (EBFP2 חיובי) הוא הרבה פחות מסובך מאשר באמצעות משלוח RNP, וזה קל להכין את plasmids. זה נכון שפרוטוקול זה מסתמך על מיון תא בודד. אבל הפרוטוקול שלנו קל לביצוע ומפיק שינויים מוצלחים בנוק-אין עם יכולת רבייה גבוהה.

ביטוי של POI מהלוקוס Rosa26
ישנם דיווחים מרובים בספרות המתארים שיטות לתיוג חלבונים אנדוגניים עם כתבים פלואורסצנטיים באמצעות CRISPR / Cas9 עריכה40,41,42. היתרונות של תיוג אנדוגני הם שזה אפשרי לקבוע לוקליזציה תת תאית ולבצע במעקב vivo של חלבון אנדוגני. עם זאת, בעיות עשויות להיתקל אם לא ניתן לעצב RNA מדריך CRIPSR מתאים בלוקוס אנדוגני. כאן פיתחנו שיטת נוק-אין חלופית על ידי שילוב POI-IRES-EBFP2 לתוך locus הנמל הבטוח הגנומי Rosa26, אשר מתגבר על המגבלות של מציאת מדריכים מתאימים למיקום תגים אנדוגני.

אנו מסכמים כמה נקודות מפתח שיש לקחת בחשבון במהלך הניסויים כדי להבטיח רבייה טכנית. ראשית, ממיין התא צריך לייזר סגול 405 ננומטר עבור עירור של EBFP2 ולייזר כחול 488 ננומטר או לחילופין לייזר צהוב 561 ננומטר עבור עירור של DsRed2. עם תצורות כאלה, EBFP2 ו- DsRed2 ניתן לזהות ללא גלישה ספקטרלית, אשר עלול להוביל לתוצאות חיוביות שווא. בניסויים שלנו, שיעור DsRed2+ EBFP2+ תאים חיוביים כפולים היה נמוך ככל 0.9%; לכן, גטינג של האוכלוסייה הנכונה היה חיוני להצלחת הניסויים. סיבוב שני של מיון בוצע כדי שער EBFP2+ תאים חיוביים, ואחריו אימות PCR. בנוסף, לגילוי חלבון נוק-אין, עדיף להציג תג חלבון כגון OST או סוג אחר של תג. נוקאאוט של הגן לפני Rosa26 לוקוס נוק-אין ניסויים מספק הזדמנות טובה להעריך אם הנוגדן יש ספציפיות רצויה. כאשר הספציפיות של הנוגדנים אינה מספיקה, זיהוי חלבון הנוק-אין צריך להתבצע לאחר משיכה למטה באמצעות תג החלבון. לבסוף, במהלך הקרנת FACS של התאים המבטאים את הנוק-אין allele, ניתן להשתמש בעוצמת EBFP2 כדי להעריך אם שני עותקים או עותק אחד של allele knock-in קיים.

יישומים
בפרוטוקול זה תיארנו את שינוי הנוק-אין של RASGRP1, מולקולת מפתח המעורבת בהפעלת תא T27. השגנו לראשונה תאי RASGRP1-knockout Jurkat אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים אובדן תפקוד, ויצרנו תאים Jurkat נוספים מבטא OST-RASGRP1 ב לוקוס hROSA26. תאי Jurkat הם קו התא האנושי הנפוץ ביותר לחקר ביולוגיה של תא T43. בגלל ההצלחה של אימונותרפיה במניעת תשישות תאי T בחולי סרטן, אימונולוגים וביולוגים לסרטן יש עניין רב בשינוי תאי Jurkat למחקרים פונקציונליים של מולקולות מועמדות. ראוי גם לציין כי קו התא Jurkat T משמש בדרך כלל עבור ניתוח של נתיבי איתות, אבל יש מגבלות לשימוש בקו תא זה, כמו תאים Jurkat הם יצרנים עניים של IFN-γ על גירוי44. מחקרים קודמים השתמשו הן שינוי לוקוס אנדוגני45 והנדסה גנטית ב hROSA26 לוקוס46 כדי לבצע ניסויים לדפוק בתאי Jurkat אנושי. לשתי האסטרטגיות יש יתרונות משלהן; על ידי שינוי הלוקוס האנדוגני החלבון מתבטא ככל הנראה ברמה "פיזיולוגית". שינוי נוק-אין בלוקוס hROSA26 מייצר תוצאות צפויות מכיוון שניתן להבחין בהזרמה חלופית של mRNA, ושפע החלבון שהשתנה ניתן גם הוא לזיהוי בקלות. נמלים בטוחים גנומיים אחרים, כגון אתר הנגיף הקשור לאדנו 1 (AAVS1) וקולטן כימין (מוטיב CC) 5(CCR5)47,48 ראויים לחקירה נוספת.

במחקר הקודם שלנו, כאשר Vav1-OST התבטא ברמות גבוהות יותר אצל העכבר Rosa26 לוקוס בתאי RAW264.7, אשר נמצאים בשימוש תכוף מאוד תאי מקרופאגים, הצלחנו לזהות את האינטראקציה שלה עם מולקולות Vav3 מבוטאות נמוך בגלל רמות גבוהות של חלבון פיתיון ויעילות גבוהה של טיהור זיקה OST13. תיארנו גם ניסויים נוק-אין כדי להקים קו תא מקרופאג ביציבות מבטא hACE2, קולטן עבור SARS-CoV-2, שבו ביטוי בשפע מובטח. במסד הנתונים של ריצוף RNA של תא יחיד, מורינה אייס2 מתבטאת במקרופג'ים של ריאות, והמודל התאי הגנטי המבטא hACE2 שפיתחנו יכול להיות שימושי למחקרים של מקרופאגים במהלך זיהום SARS-CoV-2.

שיקולים אחרים
פרוטוקול זה נועד לזהות תאים דופקים המבטאים POI בעזרת ניתוחים ציטומטריים זרימה של כתב פלואורסצנטי, במקרה שלנו כתב EBFP2. עם זאת, כאשר נוגדני תיוג פני השטח הניתנים לזיהוי על ידי FACS זמינים עבור חלבון פני השטח49, אין צורך להשתמש במערכת הכתב50. קווי תאי T ותאי מקרופאג', כמו גם הדוגמאות של חלבונים מתויגים OST המשמשים למחקרי interactome, משמשים בעיקר למחקרי איתות, ורוב מולקולות האיתות האלה ממוקמות בציטוסול או בגרעין של תאים. לכן, כתב פלואורסצנטי עשוי להידרש לזיהוי של תאים נוק-אין רצויים.

חשוב לציין כי פרוטוקול זה פותח עבור קווי תאים, ויישום לתאי מערכת החיסון העיקריים כגון תאי T, מונוציטים/מקרופאגים לא אומת. בגלל היכולת המוגבלת של התאים להתרבות, אנחנו לא ממליצים על פרוטוקול זה לשימוש עם תאי מערכת החיסון העיקריים. כפי שהכתב הפלואורסצנטי EBFP2 התבטא תחת אותו מקדם כמו הגן הנוק-אין או POI באמצעות אלמנט IRES, לא ראינו תאים המבטאים את הכתב הפלואורסצנטי בהיעדר הגן knock-in. אנו חושדים כי ההתאוששות של תאים מבטאי חלבון פלואורסצנטי תלויה מאוד בהצלחת רקומבינציה הומולוגית. כפי שדווח במחקר קודם, זה מייגע למיין, להרחיב, ולזהות את התאים הנכונים לדפוק ב על ידי מיון תא יחיד כאשר יעילות knock-in הוא נמוך מאוד42, אשר גם מסביר מדוע היינו צריכים למיין את התאים בכמויות גדולות כדי לשפר את שיעור ההצלחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של האוניברסיטה הרפואית שינש'יאנג. פיתוח של טכנולוגיה כזו נתמך על ידי מענקי NSFC 81601360 LZ, 81471595 32070898 ל- YL. העבודה נתמכת גם על ידי קרן ועדת החינוך של הנאן מס ' 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 177 נוק-אין CRISPR/Cas9 Rosa26 מקרופאג' תא T hACE2
נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter