التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا
Summary
في هذا البروتوكول، نقدم الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة التي تقوم على المجهر الحي الخلية. نحن نقدم أداة حسابية مفتوحة المصدر للتجزئة غير المتحيزة للخلايا المسماة بالفلورسنت والتحليل الكمي لديناميكيات اللاميلبوديا أثناء انتشار الخلايا.
Abstract
انتشار الخلية هو عملية ديناميكية تعلق فيها الخلية المعلقة في الوسائط على الركيزة وتسطيح نفسها من شكل مدور إلى شكل رقيق ومنتشر. بعد مرفق ركيزة الخلية، تشكل الخلية ورقة رقيقة من اللاميليبوديا المنبثقة من جسم الخلية. في اللاميلبوديا ، يبوليمر أكتين كروي (G-actin) إلى شبكة أكتين خيوط كثيفة (F-actin) تدفع ضد غشاء البلازما ، وبالتالي توفير القوى الميكانيكية اللازمة للخلية للانتشار. وتجدر الإشارة إلى أن اللاعبين الجزيئيين الذين يتحكمون في بلمرة أكتين في اللاميلبوديا ضروريون للعديد من العمليات الخلوية الأخرى ، مثل هجرة الخلايا وداء الغدد الصماء.
منذ انتشار الخلايا تشكل lamellipodia المستمر التي تمتد على محيط الخلية بأكملها والتوسع باستمرار إلى الخارج، أصبحت المقايسات انتشار الخلايا أداة فعالة لتقييم حركية نتوءات اللاميليبوديال. وعلى الرغم من وضع عدة تطبيقات تقنية للتشتيت الذي ينشر الخلية، فإن هناك نقصا في وصف مفصل لسير العمل، الذي سيشمل بروتوكولا تدريجيا وأدوات حسابية لتحليل البيانات. هنا، نقوم بوصف الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة وتقديم أداة مفتوحة المصدر للتحليل الكمي وغير المتحيز لديناميكيات حافة الخلية أثناء الانتشار. عندما يقترن التلاعب الدوائي و / أو تقنيات إسكات الجينات ، وهذا البروتوكول قابلة لشاشة واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية التي تنظم نتوءات lamellipodial.
Introduction
نتوءات لاميليبوديال هي هياكل هيكلية خلوية بارزة تشكلت في الجزء الأمامي من الخلية المهاجرة. في lamellipodia، البلمرة من أكتين بمساعدة مجمع Arp2/3 وفورمين يخلق شبكة أكتين المتفرعة سريعة النمو التي تدفع ضد غشاء البلازما1،2. دفع القوة التي ولدتها شبكة actin يدفع جسديا الخلية إلى الأمام1،3،4،5. استنفاد Arp2/3 معقدة أو تعطيل مسارات الإشارات الضرورية لproprorusions lamellipodial غالبا ما يضعف هجرة الخلايا6، 7. علىالرغممن أن هجرة الخلايا اللاميلبوديا ناقصة كما تم الإبلاغ عن 8,9, أهمية lamellipodia في هجرة الخلايا واضح كما استنفاد هذا الهيكل النتوءي يبخل قدرة الخلية على التحرك من خلال البيئات الدقيقة البيولوجية المعقدة6,10.
عائق رئيسي لفهم تنظيم lamellipodia في الخلايا المهاجرة هو التغير الطبيعي في الحركية نتوء lamellipodial، وحجم، وشكل11،12،13،14. وعلاوة على ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن lamellipodia يحمل السلوكيات النتوءية المعقدة، بما في ذلك النتوءات المتقلبة والدورية والمتسارعة14،15. بالمقارنة مع lamellipodia متغير للغاية من الخلايا المهاجرة6،16، lamellipodia شكلت خلال انتشار الخلية هي أكثر اتساقا12. منذ النشاط النتوءي للخلايا المنتشرة والمهاجرة مدفوعة بتجميعات الجزيئات الكلية المتطابقة ، والتي تشمل شبكة أكتين متفرعة ، وحزم أكتوميوسين انقباضية ، والتصاقات مصفوفة الخلايا القائمة على integrin17،18، فقد تم استخدام خلايا الانتشار على نطاق واسع كنموذج للتحقيق في تنظيم ديناميات اللاميلبوديا.
انتشار الخلية هو عملية ميكانيكية ديناميكية حيث تلتزم الخلية المعلقة أولا بركيزة من خلال التصاقات المستندة إلى integrin17و19و20 ثم تنتشر عن طريق توسيع نتوءات المستندة إلى أكتين21،22،23. خلال مرحلة الانتشار، lamellipodia المنبثقة من جسم الخلية تبرز isotropically وبإصرار مع تراجع ضئيلة أو معدومة أو المماطلة12. بروتوكولات انتشار الخلايا الأكثر استخداما هي المقايسات نقاط النهاية ، حيث يتم إصلاح خلايا الانتشار في أوقات مختلفة بعد طلاء19،24. هذه المقايسات، على الرغم من سريعة وبسيطة، محدودة في قدرتها التشخيصية للكشف عن التغيرات في الميزات الديناميكية للlamellipodia. لتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات اللاميلبوديا ، كانت مجموعة شيتز رائدة في استخدام التحليل الكمي للخلايا الحية المنتشرة وكشفت عن العديد من الخصائص الأساسية لنتوءات حافة الخلية11و12و22. وقد أظهرت هذه الدراسات أن الخلايا الحية نشر المقايسة هو تقنية قوية وقوية في صندوق أدوات مختبر بيولوجيا الخلية. وعلى الرغم من ذلك، فإن البروتوكول التفصيلي والأداة الحسابية مفتوحة المصدر لإجراء فحص للخلايا الحية المنتشرة غير متاحة حاليا لمجتمع بيولوجيا الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، يحدد بروتوكولنا إجراءات تصوير خلايا الانتشار الحي ويوفر أداة تحليل تلقائي للصور. للتحقق من صحة هذه الطريقة، استخدمنا Arp2/3 تثبيط كعلاج تجريبي وأظهرت أن تثبيط وظيفة مجمع Arp2/3 لم يوقف انتشار الخلايا ولكن تسبب في انخفاض كبير في سرعة نتوء الخلية، فضلا عن استقرار نتوءات حافة الخلية، مما أدى إلى حواف الخلية خشنة. هذه البيانات تثبت أن الجمع بين التصوير بالخلايا الحية وتحليل الصور الآلي هو أداة مفيدة لتحليل ديناميات حافة الخلية وتحديد المكونات الجزيئية التي تنظم lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح المقايسة المنتشرة للخلية الموصوفة بالتتبع المستمر للتغيرات المورفولوجية(على سبيل المثال ، حجم الخلية وشكلها) وحركات حافة الخلية(أي سرعة النتوء وتردد التراجع) ، وهي ميزات مفقودة في معظم بروتوكولات انتشار الخلايا19،24. في حين أن شائعة الاستخدا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المحقق الجديد لصندوق كونوت ل S.P. ، المؤسسة الكندية للابتكار ، برنامج منح اكتشاف NSERC (المنح RGPIN-2015-05114 و RGPIN-2020-05881) ، صندوق الأبحاث المشتركة لجامعة مانشستر وجامعة تورنتو ، وبرنامج جامعة تورونتو XSeed.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
