Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular
Summary
Neste protocolo, apresentamos os procedimentos experimentais de um ensaio de difusão celular que é baseado em microscopia de células vivas. Fornecemos uma ferramenta computacional de código aberto para a segmentação imparcial de células fluorescentes rotuladas e análise quantitativa da dinâmica da lamellipodia durante a disseminação celular.
Abstract
A disseminação celular é um processo dinâmico no qual uma célula suspensa em mídia se conecta a um substrato e se achata de uma forma arredondada para uma forma fina e espalhada. Seguindo o acessório de substrato celular, a célula forma uma fina folha de lamellipodia emanando do corpo celular. Na lamellipodia, os monômeros globulares (G-actin) polimerizam-se em uma densa malha de ato desordenada (F-actin) que empurra contra a membrana plasmática, fornecendo assim as forças mecânicas necessárias para que a célula se espalhe. Notavelmente, os atores moleculares que controlam a polimerização de actina na lamellipodia são essenciais para muitos outros processos celulares, como migração celular e endocitose.
Uma vez que a disseminação de células forma lamellipodia contínua que abrange toda a periferia celular e se expande persistentemente para fora, ensaios de disseminação celular tornaram-se uma ferramenta eficiente para avaliar a cinética das protrusões lamellipodial. Embora várias implementações técnicas do ensaio de disseminação de células tenham sido desenvolvidas, uma descrição detalhada do fluxo de trabalho, que incluiria um protocolo passo a passo e ferramentas computacionais para análise de dados, está atualmente em falta. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais do ensaio de disseminação celular e apresentamos uma ferramenta de código aberto para análise quantitativa e imparcial da dinâmica da borda celular durante a disseminação. Quando combinado com manipulações farmacológicas e/ou técnicas de silenciamento de genes, este protocolo é favorável a uma tela em larga escala de jogadores moleculares que regulam saliências lamellipodiais.
Introduction
As saliências lamellipodias são estruturas citoesqueléticos proeminentes formadas na frente de uma célula migratória. Em lamellipodia, a polimerização do actin com o auxílio do complexo Arp2/3 e formins cria um trabalho de malha de actina ramificada de rápido crescimento que empurra contra a membrana plasmática1,2. A força de empurrão gerada pelo trabalho de malha de actina impulsiona fisicamente a célula para a frente1,3,4,5. Esgotamento do complexo Arp2/3 ou interrupção de vias de sinalização essenciais para saliências lamellipodias muitas vezes prejudicam a migração celular6, 7. Embora a migração de células deficientes de lamellipodia também tenha sido relatada8,9, a importância da lamellipodia na migração celular é evidente como o esgotamento dessa estrutura protrusiva perturba a capacidade da célula de se mover através de microambientes biológicos complexos6,10.
Um grande empecilho para entender a regulação da lamellipodia em células migratórias é a variabilidade natural na cinética de protrusão lamellipodial, tamanho e forma11,12,13,14. Além disso, estudos recentes demonstraram que a lamellipodia apresenta comportamentos salitivos complexos, incluindo saliências flutuantes, periódicas e aceleradas14,15. Em comparação com a lamellipodia altamente variável das células migratórias6,16, a lamellipodia formada durante a disseminação celular são mais uniformes12. Uma vez que a atividade strusiva de células disseminadas e migratórias é impulsionada por conjuntos macromoleculares idênticos, que incluem uma rede de actina ramificada, feixes de actomyosina contracttil e aderências de matriz celular baseada em integrin17,18, células disseminadas têm sido amplamente utilizadas como modelo para investigar a regulação da dinâmica da lamellipodia.
A disseminação celular é um processo mecanoquímico dinâmico onde uma célula em suspensão primeiro adere a um substrato através de aderências baseadas em integrin17,19,20 e, emseguida,se espalha estendendo as saliências baseadas em actina21,22,23. Durante a fase de disseminação, a lamellipodia emanando do corpo celular protuberante e persistentemente com pouca ou nenhuma retração ou paralisação12. Os protocolos de disseminação de células mais usados são os ensaios de pontos finais, onde as células de disseminação são fixadas em vários momentos após o revestimento19,24. Estes ensaios, embora rápidos e simples, são limitados em seu poder de diagnóstico para detectar alterações nas características dinâmicas da lamellipodia. Para determinar os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica da lamellipodia, o grupo Sheetz foi pioneiro no uso da análise quantitativa de células vivas e descobriu muitas propriedades fundamentais das saliências de borda celular11,12,22. Esses estudos demonstraram que o ensaio de disseminação de células vivas é uma técnica robusta e poderosa na caixa de ferramentas de um laboratório de biologia celular. Apesar disso, um protocolo detalhado e uma ferramenta computacional de código aberto para um ensaio de espalhamento de células vivas estão atualmente indisponíveis para a comunidade de biologia celular. Para isso, nosso protocolo descreve os procedimentos de imagens ao vivo espalhando células e fornece uma ferramenta automatizada de análise de imagens. Para validar este método, utilizamos a inibição de Arp2/3 como tratamento experimental e mostramos que inibir a função do complexo Arp2/3 não dedundo a propagação celular, mas causou uma redução significativa na velocidade de saliência celular, bem como a estabilidade das saliências da borda celular, dando origem a bordas celulares irregulares. Esses dados demonstram que a combinação de imagens de células vivas e análise automatizada de imagens é uma ferramenta útil para analisar a dinâmica das bordas celulares e identificar componentes moleculares que regulam a lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de disseminação de células descrito permite o rastreamento contínuo de alterações morfológicas (por exemplo, tamanho e forma da célula) e movimentos de borda celular(ou seja, velocidade de saliência e frequência de retração), que são características ausentes na maioria dos protocolos de disseminaçãocelular 19,24. Embora os ensaios de disseminação de células de ponto final comumente usados permitam a determinação da …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
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