Количественный анализ динамики края клетки во время распространения клеток
Summary
В этом протоколе мы представляем экспериментальные процедуры анализа распространения клеток, основанного на живоклеточной микроскопии. Мы предоставляем вычислительный инструмент с открытым исходным кодом для объективной сегментации флуоресцентно помеченных клеток и количественного анализа динамики ламеллиподии во время распространения клеток.
Abstract
Распространение клеток представляет собой динамический процесс, при котором ячейка, подвешенная в средствах массовой информации, прикрепляется к субстрату и выравнивается от округлой до тонкой и распределимой формы. Следуя клеточному субстрату, клетка образует тонкий лист ламеллиподии, исходящий из клеточного тела. В ламеллиподии, шаровые актин (G-actin) мономеры полимеризируются в плотный нитементный актин (F-актин) сетки, которая толкает против плазменной мембраны, тем самым обеспечивая механические силы, необходимые для клетки распространяться. Примечательно, что молекулярные игроки, которые контролируют актин полимеризации в lamellipodia имеют важное значение для многих других клеточных процессов, таких как миграция клеток и эндоцитоз.
Так как распространяющиеся клетки образуют непрерывную ламеллиподию, которая охватывает всю периферию клеток и постоянно расширяется наружу, распространяющие клетки анализы стали эффективным инструментом оценки кинетики ламеллиподиальных выступов. Хотя было разработано несколько технических реализаций анализа распространения клеток, в настоящее время отсутствует подробное описание рабочего процесса, которое будет включать как пошаговой протокол, так и вычислительные инструменты для анализа данных. Здесь мы описываем экспериментальные процедуры анализа распространения клеток и представляем инструмент с открытым исходным кодом для количественного и беспристрастного анализа динамики края клетки во время распространения. В сочетании с фармакологическими манипуляциями и/или генно-заглушающих методов, этот протокол является подложным к крупномасштабному экрану молекулярных игроков, регулирующих lamellipodial выступы.
Introduction
Ламеллиподные выступы являются выдающимися цитоскелетными структурами, образованными в передней части мигрирующей клетки. В lamellipodia, полимеризация актина с помощью комплекса Arp2/3 и формин создает быстрорастущие разветвленной актинные сетки, которая толкает против плазменноймембраны 1,2. Сила нажатия, генерируемая актиальной сеткой, физически продвигаетячейку вперед 1,3,4,5. Истощение комплекса Arp2/3 или нарушение сигнальных путей, необходимых для ламеллиподных выступов, часто ухудшаетмиграцию клеток 6, 7. Хотя миграция ламеллиподии-дефицитных клетоктакже сообщалось 8,9, важность lamellipodia в миграции клеток очевидна, как истощение этой протрусской структуры возмущает способность клетки двигаться через сложные биологические микроокноронности6,10.
Основным препятствием для понимания регулирования lamellipodia в мигрирующих клетках является естественная изменчивость в lamellipodial выступ кинетики,размер, и форма 11,12,13,14. Кроме того, недавние исследования показали, что ламеллиподия обладают сложным протрусивным поведением, включая колебания, периодические иускоряющиеся выступы 14,15. По сравнению с весьма переменной lamellipodia мигрирующихклеток 6,16, lamellipodia формируется во время распространения клеток являются болееравномерной 12. Так как протрусическая активность распространяющихся и мигрирующих клеток определяется идентичными макромолекулярными сборками, которые включают разветвленную актиновую сеть, контрактильные актомиозинные пучки и интегрин-матрицы17,18, распространяющиеся клетки широко используются в качестве модели для изучения регулирования динамики ламеллиподии.
Распространение клеток является динамическим механохимическим процессом, где клетка в подвеске сначала прилипает к субстрату через интегрин на основе спаек17,19,20, а затем распространяется путем расширения актин-основевыступов 21,22,23. Во время фазы распространения, lamellipodia, вытекающих из клеточного тела выступают изотропически и настойчиво практически без опрокидывания или срыва12. Наиболее часто используемые протоколы распространения клеток являются анализом конечных точек, где распространяющиеся ячейки фиксируются в разное времяпосле покрытия 19,24. Эти анализы, хотя и быстро и просто, ограничены в своей диагностической мощности для обнаружения изменений в динамических особенностей lamellipodia. Чтобы определить молекулярные механизмы, которые контролируют динамику ламеллиподии, группа Sheetz впервые использовал количественный анализ живых распространяющих клеток и обнаружил много фундаментальных свойстввыступов края клетки 11,12,22. Эти исследования показали, что анализ распространения живых клеток является надежным и мощным методом в арсенале лаборатории клеточной биологии. Несмотря на это, подробный протокол и вычислительный инструмент с открытым исходным кодом для анализа распространения живой клетки в настоящее время недоступны для сообщества клеточной биологии. С этой целью в нашем протоколе излагаются процедуры визуализации живых распространяющихся клеток и предоставляется автоматизированный инструмент анализа изображений. Для проверки этого метода мы использовали ингибирование Arp2/3 в качестве экспериментального лечения и показали, что ингибирование функции комплекса Arp2/3 не арестовало распространение клеток, но вызвало значительное снижение скорости выпячивания клеток, а также стабильность выступов края клетки, что привело к зубчатым краям клеток. Эти данные показывают, что сочетание живой клетки изображения и автоматизированного анализа изображений является полезным инструментом для анализа динамики края клетки и выявления молекулярных компонентов, которые регулируют lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный анализ распространения клеток позволяет непрерывно отслеживать морфологические изменения (например,размер клетки и форму) и движения края клетки (т.е. скорость выпячивание и частота опрокидывания), которые являются функциями, отсутствующими в большинстве протоколов<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Connaught Фонд Новый следователь премии S.P., Канадский фонд инноваций, NSERC Discovery Грант программы (гранты RGPIN-2015-05114 и RGPIN-2020-05881), Манчестерский университет и Университет Торонто Совместный исследовательский фонд, и Университет Торонто XSeed программы.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
