ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.
Abstract
הפצת תאים היא תהליך דינמי שבו תא המושעה במדיה מתחבר למצע ומשטח את עצמו מצורה מעוגלת לצורה דקה ומתפשטת. בעקבות הקובץ המצורף למצע התא, התא יוצר גיליון דק של lamellipodia הנובע מגוף התא. ב lamellipodia, אקטין כדורי (G-actin) מונומרים polymerize לתוך אקטין סיבי צפוף (F-actin) רשת שדוחף נגד קרום הפלזמה, ובכך לספק את הכוחות המכניים הדרושים עבור התא להתפשט. יש לציין כי השחקנים המולקולריים השולטים בפולמורליזציה של האקטין ב- lamellipodia חיוניים לתהליכים תאיים רבים אחרים, כגון נדידת תאים ואנדוציטוזיס.
מאז הפצת תאים טופס lamellipodia רציפה המשתרעת על פני הפריפריה התא כולו בהתמדה להתרחב כלפי חוץ, תא מתפשט מבחנים הפכו כלי יעיל כדי להעריך את הקינטיקה של בליטות lamellipodial. למרות מספר יישומים טכניים של התא מתפשט assay פותחו, תיאור מפורט של זרימת העבודה, אשר יכלול הן צעד אחר צעד פרוטוקול וכלים חישוביים לניתוח נתונים, חסר כעת. כאן אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים של התא המתפשט ומציגים כלי קוד פתוח לניתוח כמותי ובלתי משוחד של דינמיקת קצה התא במהלך ההתפשטות. בשילוב עם מניפולציות תרופתיות ו/או טכניקות להשתקת גנים, פרוטוקול זה נוח למסך בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות lamellipodial.
Introduction
בליטות Lamellipodial הם מבנים cytoskeletal בולטים שנוצרו בחזית תא נודד. ב lamellipodia, פולמריזציה של actin בעזרת קומפלקס Arp2/3 ו formins יוצר רשת actin מסועפת הגדלה במהירות שדוחפת נגד קרום הפלזמה1,2. הכוח הדוחף שנוצר על ידי רשת actin מניע פיזית את התא קדימה1,3,4,5. דלדול של Arp2/3 מורכב או שיבוש של נתיבי איתות חיוניים עבור בליטות lamellipodial לעתים קרובות לפגוע נדידת תאים6, 7. למרות ההגירה של תאים לקויים lamellipodia דווחה גם8,9, החשיבות של lamellipodia בנדידת תאים ניכרת כמו דלדול של מבנה זה protrusive מפריע ליכולתו של התא לנוע דרך microenvironments ביולוגי מורכב6,10.
מכשול מרכזי להבנת הרגולציה של lamellipodia בתאים נודדים הוא השונות הטבעית בקינטיקה בליטה lamellipodial, גודל, וצורה11,12,13,14. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי lamellipodia להפגין התנהגויות בולטות מורכבות, כולל תנודות, תקופתיות, והאצת בליטות14,15. בהשוואה lamellipodia משתנה מאוד של תאים נודדים6,16, lamellipodia נוצר במהלך התפשטות התא הם אחידים יותר12. מאז הפעילות הבולטת של הפצה והעברת תאים מונעת על ידי הרכבות מקרומולקולריות זהות, הכוללות רשת actin מסועפת, חבילות actomyosin התכווצות, הידבקויות מטריצת תאים מבוססי integrin17,18, תאים מתפשטים שימשו נרחב כמודל לחקירת הרגולציה של דינמיקה lamellipodia.
הפצת תאים היא תהליך מכני דינמי שבו תא בהשעיה תחילה דבק מצע באמצעות הידבקויות מבוססות אינגרין17,19,20 ולאחר מכן מתפשט על ידי הרחבת בליטות מבוססות actin21,22,23. במהלך שלב ההתפשטות, lamellipodia הנובעים מגוף התא בולטים isotropically בהתמדה עם מעט עד ללא נסיגה או השתהות12. הפרוטוקולים הנפוצים ביותר להפצת תאים הם מבחני קצה, שבהם תאים מתפשטים קבועים בזמנים שונים לאחר ציפוי19,24. מבחנים אלה, אם כי מהירים ופשוטים, מוגבלים בכוח האבחון שלהם כדי לזהות שינויים בתכונות הדינמיות של lamellipodia. כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים השולטים בדינמיקה של לאמליפודיה, קבוצת Sheetz הייתה חלוצה בשימוש בניתוח כמותי של תאים מתפשטים חיים וחשפה תכונות בסיסיות רבות של בליטות קצה התא11,12,22. מחקרים אלה הראו כי התסעפות המתפשטת של תאים חיים היא טכניקה חזקה ורבת עוצמה בארגז הכלים של מעבדה לביולוגיה של התא. למרות זאת, פרוטוקול מפורט וכלי חישובי בקוד פתוח לבדיקה מתפשטת של תאים חיים אינם זמינים כיום עבור הקהילה לביולוגיה של התא. למטרה זו, הפרוטוקול שלנו מתאר את ההליכים של הדמיה תאים מתפשטים חיים ומספק כלי ניתוח תמונה אוטומטי. כדי לאמת שיטה זו, השתמשנו בעיכוב Arp2/3 כטיפול ניסיוני והראינו כי עיכוב הפונקציה של קומפלקס Arp2/3 לא עצר את התפשטות התאים אלא גרם לירידה משמעותית במהירות בליטות התא, כמו גם ליציבות של בליטות קצה התא, מה שהוליד קצוות תא משוננים. נתונים אלה מראים כי השילוב של הדמיה של תאים חיים וניתוח תמונה אוטומטי הוא כלי שימושי לניתוח דינמיקה של קצה התא ולזיהוי רכיבים מולקולריים המווסתים lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני התפשטות התא המתוארים מאפשרים מעקב מתמשך אחר שינויים מורפולוגיים(למשל, גודל וצורה של תאים) ותנועות קצה תא(כלומר, מהירות בליטה ותדירות נסיגה), שהן תכונות חסרות ברוב הפרוטוקולים המתפשטים על ידי תאים19,24. בעוד תא סוף נפוץ מתפשט מבחנים מאפשרים קבי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן קונוט פרס חוקר חדש S.P., קרן קנדה לחדשנות, NSERC דיסקברי גרנט התוכנית (מענקים RGPIN-2015-05114 ו RGPIN-2020-05881), אוניברסיטת מנצ’סטר ואוניברסיטת טורונטו קרן מחקר משותף, ואוניברסיטת טורונטו XSeed תוכנית.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
