Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare
Summary
In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l’analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.
Abstract
La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l’attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell’actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell’actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l’endocitosi.
Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l’intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l’esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l’analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l’analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.
Introduction
Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell’actina con l’aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L’esaurimento del complesso Arp2/3 o l’interruzione delle vie di segnalazione essenziali per le sporgenze lamellipodiali spesso compromettono la migrazionecellulare 6, 7. Sebbene sia stata segnalata anche la migrazione di cellule carenti di lamellipodia8,9, l’importanza della lamellipodia nella migrazione cellulare è evidente in quanto l’esaurimento di questa struttura protrusiva perturba la capacità della cellula di muoversi attraverso complessi microambientatibiologici 6,10.
Uno dei principali ostacoli alla comprensione della regolazione della lamellipodia nelle cellule migratrici è la variabilità naturale nella cinetica, nelle dimensioni e nella forma della protrusione lamellipodale11,12,13,14. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i lamellipodia mostrano comportamenti protrusivi complessi, tra cui sporgenze fluttuanti, periodiche e acceleranti14,15. Rispetto alla lamellipodia altamente variabile delle cellule migratrici6,16,lamellipodia formata durante la diffusione cellulare sono piùuniformi 12. Poiché l’attività protrusiva di diffusione e migrazione delle cellule è guidata da assiemi macromolecolari identici, che includono una rete actina ramificata, fasci di actomiosina contrattili e aderenze a matrice cellulare a base di integrina17,18, le cellule di diffusione sono state ampiamente utilizzate come modello per indagare la regolazione della dinamica della lamellipodia.
La diffusione cellulare è un processo meccanochimico dinamico in cui una cellula in sospensione aderisce prima a un substrato attraverso aderenze a base di integrina17,19,20 e poi si diffonde estendendo le sporgenze a base di actina21,22,23. Durante la fase di diffusione, lamellipodia che emana dal corpo cellulare sporge isotropicamente e persistentemente con poca o nessuna retrazione o stallo12. I protocolli di diffusione cellulare più comunemente utilizzati sono test di endpoint, in cui le cellule di diffusione sono fissate in vari momenti dopo laplaccatura 19,24. Questi test, sebbene rapidi e semplici, sono limitati nel loro potere diagnostico per rilevare i cambiamenti nelle caratteristiche dinamiche della lamellipodia. Per determinare i meccanismi molecolari che controllano la dinamica lamellipodia, il gruppo Sheetz ha aperto la strada all’uso dell’analisi quantitativa delle cellule di diffusione dal vivo e ha scoperto molte proprietà fondamentali delle sporgenze dei bordi cellulari11,12,22. Questi studi hanno dimostrato che il saggio di diffusione delle cellule vive è una tecnica robusta e potente nella cassetta degli attrezzi di un laboratorio di biologia cellulare. Nonostante ciò, un protocollo dettagliato e uno strumento computazionale open source per un saggio di diffusione di cellule vive non sono attualmente disponibili per la comunità della biologia cellulare. A tal fine, il nostro protocollo delinea le procedure di imaging delle cellule di diffusione dal vivo e fornisce uno strumento automatizzato di analisi delle immagini. Per convalidare questo metodo, abbiamo usato l’inibizione dell’Arp2/3 come trattamento sperimentale e abbiamo dimostrato che inibire la funzione del complesso Arp2/3 non ha arrestato la diffusione cellulare ma ha causato una significativa riduzione della velocità di protrusione cellulare, così come la stabilità delle sporgenze del bordo cellulare, dando origine a bordi cellulari frastagliati. Questi dati dimostrano che la combinazione di imaging a cellule vive e analisi automatizzata delle immagini è uno strumento utile per analizzare la dinamica dei bordi delle cellule e identificare componenti molecolari che regolano lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
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