Análisis cuantitativo de la dinámica del borde celular durante la propagación celular
Summary
En este protocolo, presentamos los procedimientos experimentales de un ensayo de propagación celular que se basa en microscopía de células vivas. Proporcionamos una herramienta computacional de código abierto para la segmentación imparcial de células etiquetadas fluorescentemente y análisis cuantitativos de dinámicas de lamellipodia durante la propagación celular.
Abstract
La propagación celular es un proceso dinámico en el que una celda suspendida en medios se adhiere a un sustrato y se aplana de una forma redondeada a una forma delgada y dispersa. Después del apego de sustrato celular, la célula forma una fina lámina de lamellipodia que emana del cuerpo celular. En la lamellipodia, los monómeros de actina globular (G-actin) polimerizan en una densa malla de actina filamentosa (F-actin) que empuja contra la membrana plasmática, proporcionando así las fuerzas mecánicas necesarias para que la célula se propague. En particular, los actores moleculares que controlan la polimerización de actina en lamellipodia son esenciales para muchos otros procesos celulares, como la migración celular y la endocitosis.
Dado que las células de dispersión forman lamellipodia continua que abarca toda la periferia celular y se expanden persistentemente hacia afuera, los ensayos de propagación celular se han convertido en una herramienta eficiente para evaluar la cinética de las protuberancias lamellipodiales. Aunque se han desarrollado varias implementaciones técnicas del ensayo de propagación celular, actualmente falta una descripción detallada del flujo de trabajo, que incluiría tanto un protocolo paso a paso como herramientas computacionales para el análisis de datos. Aquí, describimos los procedimientos experimentales del ensayo de propagación celular y presentamos una herramienta de código abierto para el análisis cuantitativo e imparcial de la dinámica del borde celular durante la propagación. Cuando se combina con manipulaciones farmacológicas y/o técnicas de silenciamiento de genes, este protocolo es apto para una pantalla a gran escala de jugadores moleculares que regulan las protuberancias lamellipodiales.
Introduction
Las protuberancias lamellipodiales son estructuras citoesqueléticos prominentes formadas en la parte delantera de una célula migratoria. En lamellipodia, la polimerización de actina con la ayuda del complejo Arp2/3 y las fímínas crea una malla actin ramificada de rápido crecimiento que empuja contra la membrana plasmática1,2. La fuerza de empuje generada por el trabajo de malla actin impulsa físicamente la celda hacia adelante1,3,4,5. El agotamiento del complejo Arp2/3 o la interrupción de las vías de señalización esenciales para las protuberancias lamellipodiales a menudo afectan la migración celular6, 7. Aunque la migración de células deficientes en lamellipodia también se ha reportado8,9, la importancia de la lamellipodia en la migración celular es evidente ya que el agotamiento de esta estructura sobretrusiva perturba la capacidad de la célula para moverse a través de microambientes biológicos complejos6,10.
Un obstáculo importante para entender la regulación de la lamellipodia en las células migratorias es la variabilidad natural en lamellipodial protrusión cinética, tamaño, y forma11,12,13,14. Además, estudios recientes han demostrado que la lamellipodia exhibe comportamientos protrusivos complejos, incluyendo protuberancias fluctuantes, periódicas y aceleradas14,15. En comparación con la lamellipodia altamente variable de las células migratorias6,16,lamellipodia formada durante la propagación celular son más uniformes12. Dado que la actividad protrusiva de las células de propagación y migración está impulsada por conjuntos macromoleculares idénticos, que incluyen una red actin ramificada, paquetes de actomiosina contractile y adherencias de matriz celular basadas en integrina17,18,las células de propagación han sido ampliamente utilizadas como modelo para investigar la regulación de la dinámica de lamellipodia.
La propagación celular es un proceso mecanoquímico dinámico en el que una célula en suspensión se adhiere primero a un sustrato a través de adherencias basadas en integrina17,19,20 y luego se propaga extendiendo protuberancias basadas en actin21,22,23. Durante la fase de propagación, lamellipodia que emana del cuerpo celular sobresale isotrópica y persistentemente con poca o ninguna retracción o semental12. Los protocolos de propagación celular más utilizados son los ensayos de puntos finales, donde las células de dispersión se fijan en varias ocasiones después de chapar19,24. Estos ensayos, aunque rápidos y sencillos, son limitados en su poder de diagnóstico para detectar cambios en las características dinámicas de la lamellipodia. Para determinar los mecanismos moleculares que controlan la dinámica de la lamellipodia, el grupo Sheetz fue pionero en el uso del análisis cuantitativo de células de propagación en vivo y descubrió muchas propiedades fundamentales de las protuberancias de borde celular11,12,22. Estos estudios han demostrado que el ensayo de propagación de células vivas es una técnica robusta y poderosa en la caja de herramientas de un laboratorio de biología celular. A pesar de eso, un protocolo detallado y una herramienta computacional de código abierto para un ensayo de propagación de células vivas actualmente no están disponibles para la comunidad de biología celular. Con este fin, nuestro protocolo describe los procedimientos de imágenes que propagan en vivo las células y proporciona una herramienta automatizada de análisis de imágenes. Para validar este método, utilizamos la inhibición de Arp2/3 como tratamiento experimental y demostramos que la inhibición de la función del complejo Arp2/3 no detuvo la propagación celular, sino que causó una reducción significativa en la velocidad de protuberancia celular, así como la estabilidad de las protuberancias del borde celular, dando lugar a bordes celulares irregulares. Estos datos demuestran que la combinación de imágenes de células vivas y análisis automatizado de imágenes es una herramienta útil para analizar la dinámica del borde celular e identificar componentes moleculares que regulan la lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de propagación celular descrito permite el seguimiento continuo de los cambios morfológicos(por ejemplo, el tamaño y la forma de la célula) y los movimientos del borde celular(es decir, la velocidad de protuberancia y la frecuencia de retracción), que son características que faltan en la mayoría de los protocolos de propagación celular19,24. Si bien los ensayos de propagación de células de punto final utilizados comúnmente p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio Connaught Fund New Investigator a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subvenciones RGPIN-2015-05114 y RGPIN-2020-05881), University of Manchester y University of Toronto Joint Research Fund, y University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Riferimenti
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