Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme
Summary
Este artigo detalha métodos que demonstram três técnicas comuns de coleta e desagregação de biofilmes em dois tipos de superfície, testes de robustez de um método de colheita e informações mínimas a serem consideradas ao escolher e otimizar técnicas de colheita e desagregação para aumentar a reprodutibilidade.
Abstract
Os métodos de biofilme consistem em quatro etapas distintas: o crescimento do biofilme em um modelo relevante, o tratamento do biofilme maduro, a colheita do biofilme da superfície e a desagregação dos aglomerados e a análise da amostra. Das quatro etapas, a colheita e a desagregação são as menos estudadas, mas ainda assim críticas quando se considera o potencial de viés de teste. Este artigo demonstra técnicas de colheita e desagregação comumente utilizadas para biofilme cultivado em três superfícies diferentes. As três técnicas de coleta e desagregação de biofilmes, obtidas a partir de uma extensa revisão da literatura, incluem vórtice e sônica, raspagem e homogeneização, raspagem, vórtice e sônicação. Dois tipos de superfície são considerados: duro não poroso (policarbonato e vidro borossilicato) e poroso (silicone). Além disso, fornecemos recomendações para as informações mínimas que devem ser incluídas ao relatar a técnica de colheita seguida e um método de acompanhamento para verificar o viés.
Introduction
A definição de biofilme evoluiu ao longo das últimas décadas e engloba a associação microbiana com uma variedade de superfícies biológicas e/ou não biológicas, inclusão de componentes nãocelulares1 que apresentam crescimento diferente e expressão genética2 dentro de uma matriz. O biofilme fornece proteção contra estresses ambientais, como a secagem, pode tornar a ação de desinfetantes químicos menos eficaz, resultando na sobrevivência de micróbios. Os sobreviventes dentro de um biofilme podem potencialmente fornecer uma fonte de microrganismos patogênicos que são uma preocupação de saúde pública3.
Os métodos de biofilme são compostos por quatro etapas, crescimento, tratamento, amostragem (colheita e desagregação) e análise. O crescimento, o primeiro passo, onde o usuário determina as condições de crescimento do organismo, temperatura, mídia, etc., é o mais considerado e relatado na literatura de biofilme4,5,6,7. A etapa de tratamento avalia os antimicrobianos (por exemplo, desinfetantes) para determinar sua eficácia, seja contra um biofilme maduro3,8,9 ou o antimicrobiano pode ser incorporado à superfície para determinar a capacidade do produto de prevenir ou reduzir o crescimento do biofilme10. O terceiro passo, amostragem, inclui etapas para colher o biofilme da superfície em que estava crescendo e desagregar os aglomerados removidos3,8,11. A quarta etapa, análise, pode incluir contagem de células viáveis, microscopia, medidas de fluorescência, desfechos moleculares e/ou uma avaliação de componentes matricia8,9. A avaliação dos dados fornece informações sobre o resultado de um experimento. Dos quatro, a amostragem é muitas vezes o passo mais negligenciado porque presume que a técnica de colheita de biofilme e/ou desagregação escolhida é 100% eficaz, muitas vezes sem verificação11.
Suspensões planctônicas de bactérias, muitas vezes consideradas homogêneas, requerem vórtice simples antes da análise. Os biofilmes, no entanto, são comunidades complexas compostas por microrganismos (procarióticos e/ou eucarióticos), exopolysacarídeos, proteínas, lipídios, DNA extracelular e células hospedeiras12. Passos além dos métodos tradicionais de cultura microbiológica planctônica são necessários para colher adequadamente o biofilme de uma superfície e, em seguida, desagregá-lo em uma suspensão celular única homogênea. Uma extensa revisão da literatura (informações não incluídas nesta publicação) demonstrou que a escolha da técnica de remoção e desagregação depende de uma série de fatores, incluindo espécies presentes no biofilme, superfície a que o biofilme está ligado (não poroso ou poroso), acessibilidade a superfícies de crescimento (cupom facilmente removível ou destruição física de aparelhos nos quais o biofilme está crescendo), geometria da superfície (área e forma), densidade de biofilme em superfícies de crescimento e equipamentos de laboratório disponíveis.
Quando o biofilme é colhido de uma superfície, a suspensão celular resultante é heterogênea. Se essa suspensão não uniforme for enumerada com precisão, ela deve ser desagregada em células individuais. As placas viáveis assumem que uma unidade formadora de colônias se origina de uma bactéria. Se os agregados de biofilme forem colocados no meio de crescimento, é impossível distinguir células individuais que poderiam levar a estimativas imprecisas. Por exemplo, durante o teste de eficácia desinfetante, se um tratamento remover o biofilme de forma muito eficaz de uma superfície em comparação com o controle, a redução do tronco pode parecer artificialmente grande em comparação com o controle. Por outro lado, um desinfetante químico que fixa biofilme em uma superfície em comparação com o controle parecerá ter uma redução menor do tronco11. Esse tipo de cenário pode levar a uma interpretação tendenciosa dos dados experimentais.
Em preparação para a publicação, uma revisão da literatura determinou que abordagens comuns à colheita e desagregação do biofilme incluem raspagem, swabbing, sonicação, vórtice ou uma combinação destes. A raspagem é definida como remoção física de biofilme de superfícies com uma vara estéril, espátula ou outra ferramenta. Swabbing refere-se à remoção de biofilme de superfícies com uma vara de ponta de algodão ou outro material absorvente fixo. A sônica refere-se à interrupção do biofilme das superfícies através de ondas ultrassônicas distribuídas através da água. Vortexing refere-se ao uso de uma batedeira para alcançar um vórtice líquido da amostra dentro de um tubo. A homogeneização utiliza lâminas rotativas para tesourar aglomerados de biofilme colhidos em uma única suspensão celular. Neste artigo, apresentamos três métodos de colheita e desagregação para dois tipos de superfície diferentes, duros/não porosos e porosos.
Uma lista de informações mínimas recomendadas que os pesquisadores devem incluir nos métodos seções de publicações é fornecida. Esperamos que a inclusão dessas informações permita que outros pesquisadores reproduzam seu trabalho. Não há um método perfeito de colheita e desagregação, portanto, recomendações de como verificar a técnica também são fornecidas.
Três métodos comuns para colher e desagregar biofilme de superfícies comuns de crescimento são demonstrados neste artigo. Essas informações permitirão aos pesquisadores entender melhor a precisão e o viés geral de um método de teste de biofilme. Os métodos descritos são os seguintes: (1) Um biofilme pseudomonas aeruginosa cultivado em cupons de policarbonato (superfície não porosa dura) sob cisalhamento de fluidos elevados no Reator de Biofilme CDC é colhido e desagregado após uma combinação de cinco passos de vórtice e sonicação para alcançar a colheita de biofilme e desagregação (2) A Aeruginosa biofilme cultivado em cupons de vidro borossilicato (superfície não porosa dura) no reator de fluxo de gotejamento sob cisalhamento de baixo fluido é colhido e desagregado usando raspagem e homogeneização (3) Um biofilme Escherichia coli cultivado em tubos de silicone (superfície porosa) é colhido e desagregadoreg usando raspagem, seguido de sonicação e vórtice.
Protocol
Representative Results
Discussion
Informações mínimas para métodos de colheita e desagregação
Para criar dados reprodutíveis de biofilme em toda a comunidade científica, é imprescindível que os autores incluam o máximo de detalhes possível em relação a cada uma das etapas de crescimento, tratamento, amostragem e análise de um método de biofilme. A padronização dos métodos de biofilme tem auxiliado nesse esforço, pois permite ao pesquisador referenciar um método específico e quaisquer modificações relevantes. No…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos reconhecer Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee por suas contribuições para este artigo.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
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