يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتلطيخ التألق المناعي للحوامل المسطحة لشبكية العين لدى الفئران وتحليلها. يتم وصف استخدام تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) لجراء الفئران ومعالجة الصور بالتفصيل أيضا.
يستخدم اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) على نطاق واسع لدراسة نمو الأوعية غير الطبيعي في أمراض الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO). معظم دراسات OIR تلاحظ الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين في نقاط زمنية محددة. ومع ذلك ، فإن نمو الأوعية الديناميكي في الفئران الحية على طول مسار زمني ، وهو أمر ضروري لفهم أمراض الأوعية المرتبطة ب OIR ، لم تتم دراسته بشكل كاف. هنا ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لتحريض نموذج الماوس OIR ، مع تسليط الضوء على المزالق المحتملة ، وتوفير طريقة محسنة لتحديد مناطق طمس الأوعية (VO) والأوعية الدموية الجديدة (NV) بسرعة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. الأهم من ذلك ، قمنا بمراقبة إعادة نمو الأوعية في الفئران الحية من P15 إلى P25 عن طريق إجراء تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) في نموذج فأر OIR. يسمح لنا تطبيق FFA على نموذج الماوس OIR بمراقبة عملية إعادة التشكيل أثناء إعادة نمو السفينة.
عادة ما تمتد الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية (RNV)، والتي تعرف بأنها حالة تنشأ فيها أوعية مرضية جديدة من الأوردة الشبكية الموجودة، على طول السطح الداخلي للشبكية وتنمو في الجسم الزجاجي (أو الفضاء تحت الشبكية في ظل بعض الظروف)1. وهو سمة مميزة وسمة مشتركة للعديد من اعتلالات الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)2.
أشارت العديد من الملاحظات السريرية والتجريبية إلى أن نقص التروية هو السبب الرئيسي لتوسع الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية 3,4. في شرطة عمان السلطانية، يتعرض حديثي الولادة لأكسجين عالي المستوى في حاضنات مغلقة لزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة، وهو أيضا محرك مهم لوقف نمو الأوعية الدموية. بعد الانتهاء من العلاج ، تعاني شبكية العين من الأطفال حديثي الولادة من فترة نقص الأكسجة نسبيا5. وينظر إلى حالات أخرى في انسداد الأوردة الشبكية المركزية أو الفرعية في RVO ويلاحظ أيضا تلف الشعيرات الدموية في الشبكية الذي يسببه اعتلال الأوعية الدقيقة في PDR2. يزيد نقص الأكسجة من التعبير عن العوامل الوعائية المنشأ مثل عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من خلال مسار إشارات العامل الناجم عن نقص الأكسجة -1α (HIF-1α) والذي بدوره يوجه الخلايا البطانية الوعائية للنمو في منطقة نقص الأكسجة وتشكيل أوعية جديدة 6,7.
ROP هو نوع من اعتلال الشبكية التكاثري الوعائي عند الأطفال الخدج وسبب رئيسي لعمى الأطفال8,9 ، والذي يتميز بنقص الأكسجة في الشبكية ، والأوعية الدموية الجديدة في الشبكية وتضخم التنسج الليفي10,11,12. في 1950s ، وجد الباحثون أن التركيز العالي للأكسجين يمكن أن يحسن بشكل كبير الأعراض التنفسية للأطفال الخدج13,14. ونتيجة لذلك ، تم استخدام العلاج بالأكسجين بشكل متزايد في الأطفال الخدج في ذلك الوقت15. ومع ذلك ، بالتزامن مع الاستخدام الواسع النطاق للعلاج بالأكسجين في الأطفال الخدج ، زاد حدوث ROP عاما بعد عام. ومنذ ذلك الحين، ربط الباحثون الأكسجين بشرطة عمان السلطانية، مستكشفين نماذج حيوانية مختلفة لفهم التسبب في ROP و RNV16.
في الإنسان ، يتم الانتهاء من معظم تطوير الأوعية الدموية في الشبكية قبل الولادة بينما في القوارض تتطور الأوعية الدموية الشبكية بعد الولادة ، مما يوفر نظاما نموذجيا يمكن الوصول إليه لدراسة تكوين الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الشبكية2. مع التقدم المستمر للبحث ، أصبحت نماذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) نماذج رئيسية لمحاكاة تولد الأوعية الدموية المرضية الناتجة عن نقص التروية. لا توجد أنواع حيوانية محددة في دراسة نموذج OIR وقد تم تطوير النموذج في أنواع حيوانية مختلفة ، بما في ذلك القطالصغير 17 ، والفئران18 ، والفأر19 ، وجرو البيجل20 ، والزرد21. تشترك جميع النماذج في نفس الآلية التي تتعرض من خلالها لفرط التأكسج أثناء تطور الشبكية المبكر ثم تعود إلى البيئة المعيارية. لاحظ سميث وآخرون أن تعريض الجراء الفئران لفرط التأكسج من P7 لمدة 5 أيام أدى إلى شكل متطرف من انحدار الأوعية الدموية في شبكية العين المركزية وإعادتها إلى هواء الغرفة في P12 أدى تدريجيا إلى خصلات الأوعية الدموية الجديدة ، والتي نمت نحو الجسم الزجاجي19. كان هذا نموذج ماوس OIR موحد يسمى أيضا نموذج سميث. وقام كونور وآخرون بتحسين البروتوكول وقدموا طريقة قابلة للتطبيق عالميا لتحديد مساحة VO (طمس الأوعية) و NV (الأوعية الدموية الجديدة) في عام 2009 ، مما زاد من قبول واستخدام النموذج22. لا يزال نموذج الماوس OIR هو النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع الآن بسبب صغر حجمه ، وتكاثره السريع ، وخلفيته الوراثية الواضحة ، وقابليته للتكرار الجيد ، ومعدل نجاحه العالي.
في الفئران ، تبدأ الأوعية الدموية في الشبكية بعد الولادة مع نمو الأوعية من رأس العصب البصري إلى شبكية العين الداخلية نحو أورا سيراتا. أثناء نمو الشبكية الطبيعي، تنبت الأوعية الشبكية الأولى من رأس العصب البصري حول الولادة، وتشكل شبكة موسعة (الضفيرة الأولية) التي تصل إلى المحيط حول يوم ما بعد الولادة 7 (P7)23. ثم تبدأ الأوعية في النمو في شبكية العين لتشكيل طبقة عميقة ، واختراق شبكية العين ، وإنشاء شبكة صفائحية حول الطبقة النووية الداخلية (INL) كما هو الحال في الإنسان24. بحلول نهاية الأسبوع الثالث بعد الولادة (P21) ، اكتمل تقريبا تطور الضفيرة الأعمق. بالنسبة لنموذج الماوس OIR ، يظهر انسداد الأوعية الدموية دائما في شبكية العين المركزية بسبب الانحطاط السريع لعدد كبير من شبكات الأوعية الدموية غير الناضجة في المنطقة الوسطى أثناء التعرض لفرط التأكسج. لذلك ، يحدث نمو الأوعية الدموية الجديدة المرضية أيضا في شبكية العين المحيطية الوسطى ، وهي حدود المنطقة غير التروية ومنطقة الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فقد تشكلت أوعية الشبكية البشرية تقريبا قبل الولادة. أما بالنسبة للأطفال الخدج، فإن شبكية العين الطرفية ليست وعائية بالكامل عند تعرضها لفرط التأكسج25,26. لذلك يظهر انسداد الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة بشكل رئيسي في شبكية العين الطرفية27,28. على الرغم من هذه الاختلافات ، فإن نموذج OIR للفأر يلخص عن كثب الأحداث المرضية التي تحدث أثناء الأوعية الدموية الجديدة الناجمة عن نقص التروية.
يمكن تقسيم تحريض نموذج OIR إلى مرحلتين29: في المرحلة 1 (مرحلة فرط التأكسج) ، يتم إيقاف نمو الأوعية الدموية في شبكية العين أو تخلفه مع انسداد وانحدار الأوعية الدموية نتيجة لانخفاض VEGF وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية 24,30 ؛ في المرحلة 2 (مرحلة نقص الأكسجة) ، ستصبح إمدادات الأكسجين في شبكية العين غير كافية في ظل ظروف هواء الغرفة29 ، وهو أمر ضروري للنمو العصبي والتوازن 19,31. عادة ما يؤدي هذا الوضع الإقفاري إلى توسع الأوعية الدموية الجديدة غير المنظم وغير الطبيعي.
حاليا ، طريقة النمذجة شائعة الاستخدام هي بالتناوب بين التعرض العالي / المنخفض للأكسجين: تتعرض الأمهات وصغارهن للأكسجين بنسبة 75٪ لمدة 5 أيام في P7 تليها 5 أيام في هواء الغرفة حتى أظهر P17 نتائج مماثلة22 ، وهي نقطة النهاية لتحريض نموذج الماوس OIR. (الشكل 1). بالإضافة إلى محاكاة ROP ، يمكن أيضا استخدام هذا التنسيب المرضي بوساطة نقص التروية لدراسة أمراض الشبكية الإقفارية الأخرى. تشمل القياسات الرئيسية لهذا النموذج تحديد مساحة VO و NV ، والتي يتم تحليلها من حوامل مسطحة في الشبكية عن طريق تلطيخ التألق المناعي أو تروية FITC-dextran. يمكن دراسة كل فأر مرة واحدة فقط بسبب العملية المميتة. في الوقت الحاضر ، هناك طرق قليلة لمراقبة التغيرات الديناميكية للأوعية الدموية في الشبكية بشكل مستمر أثناء عملية الانحدار الوعائي وتكوين الأوعية الدموية المرضية32. في هذه الورقة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحريض نموذج OIR ، وتحليل الحوامل المسطحة في الشبكية بالإضافة إلى سير عمل تصوير الأوعية الدموية بقاع العين (FFA) على الفئران والذي سيكون مفيدا في الحصول على فهم أكثر شمولا للتغيرات الديناميكية الوعائية خلال مرحلتين من نموذج فأر OIR.
تتأثر قابلية الفئران ل OIR بالعديد من العوامل. لا يمكن مقارنة الجراء من خلفية وراثية مختلفة وسلالات. في الفئران البيضاء BALB / c ، تنمو الأوعية مرة أخرى في منطقة VO بسرعة مع انخفاض كبير في خصلات الأوعية الدموية الجديدة38 ، والتي تجلب بعض الصعوبات للبحث. في الفئران C57BL / 6 ، هناك زيادة ف?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع الأعضاء من مختبرنا ومختبر العيون في مركز تشونغشان لطب العيون على مساعدتهم التقنية. كما نشكر البروفيسور تشونكياو ليو على الدعم التجريبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 81670872; بكين، الصين)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (المنحة رقم 2019A1515011347)، ومشروع بناء مستشفى رفيع المستوى من مختبر الدولة الرئيسي لطب العيون في مركز تشونغشان لطب العيون (المنحة رقم 303020103؛ قوانغتشو ، مقاطعة قوانغدونغ ، الصين).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |