Этот протокол описывает подробный метод приготовления и иммунофлуоресцентного окрашивания мышей с плоскими креплениями и анализа. Также подробно описано использование флуоресцеиновой ангиографии глазного дна (FFA) для детенышей мышей и обработка изображений.
Кислород-индуцированная ретинопатия (OIR) широко используется для изучения аномального роста сосудов при ишемических заболеваниях сетчатки, включая ретинопатию недоношенных (РН), пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR) и окклюзию вен сетчатки (RVO). В большинстве исследований OIR наблюдается неоваскуляризация сетчатки в определенные моменты времени; однако динамический рост сосудов у живых мышей в течение определенного времени, который необходим для понимания заболеваний сосудов, связанных с OIR, был недостаточно изучен. Здесь мы описываем пошаговый протокол для индукции мышиной модели OIR, выделяя потенциальные подводные камни и предоставляя улучшенный метод для быстрой количественной оценки областей вазооблитерации (VO) и неоваскуляризации (NV) с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Что еще более важно, мы контролировали возобновление роста сосудов у живых мышей от P15 до P25, выполняя флуоресцеиновую ангиографию глазного дна (FFA) в мышиной модели OIR. Применение FFA к мышиной модели OIR позволяет наблюдать процесс ремоделирования во время роста сосудов.
Неоваскуляризация сетчатки (РНВ), которая определяется как состояние, при котором новые патологические сосуды возникают из существующих вен сетчатки, обычно простирается вдоль внутренней поверхности сетчатки и прорастает в стекловидное тело (или субретинальное пространство при некоторых условиях)1. Это отличительная черта и общая черта многих ишемических ретинопатий, включая ретинопатию недоношенных (РН), окклюзию вен сетчатки (RVO) и пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR)2.
Многочисленные клинические и экспериментальные наблюдения показали, что ишемия является основной причиной неоваскуляризации сетчатки 3,4. При РН новорожденные подвергаются воздействию кислорода высокого уровня в закрытых инкубаторах для повышения выживаемости, что также является важным фактором для остановки роста сосудов. После того, как лечение сделано, сетчатка новорожденных испытывает относительно гипоксический период5. Другие ситуации наблюдаются при окклюзии центральных или ветвистых вен сетчатки в RVO, а также наблюдается повреждение капилляров сетчатки, которое вызвано микроангиопатией в PDR2. Гипоксия дополнительно увеличивает экспрессию ангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) через сигнальный путь, вызванный гипоксией фактор-1α (HIF-1α), который, в свою очередь, направляет эндотелиальные клетки сосудов для роста в гипоксическую область и образования новых сосудов 6,7.
РН является разновидностью сосудистой пролиферативной ретинопатии у недоношенных детей и ведущей причиной детской слепоты 8,9, для которой характерны гипоксия сетчатки, неоваскуляризация сетчатки и фиброзная гиперплазия 10,11,12. В 1950-х годах исследователи обнаружили, что высокая концентрация кислорода может значительно улучшить респираторные симптомы недоношенных детей13,14. В результате кислородная терапия все чаще применялась у недоношенных детей в то время15 лет. Однако, одновременно с широким использованием кислородной терапии у недоношенных детей, заболеваемость РН увеличивалась с каждым годом. С тех пор исследователи связали кислород с РН, изучая различные животные модели, чтобы понять патогенез РН и РНВ16.
У человека большая часть развития сосудистой системы сетчатки завершается до рождения, в то время как у грызунов сосудистая система сетчатки развивается после рождения, обеспечивая доступную модельную систему для изучения ангиогенеза в сосудистой системе сетчатки2. С непрерывным прогрессом исследований модели кислород-индуцированной ретинопатии (OIR) стали основными моделями для имитации патологического ангиогенеза в результате ишемии. В исследовании модели OIR нет конкретных видов животных, и модель была разработана для различных видов животных, включая котенка17, крысу18, мышь19, щенка бигля20 и рыбку данио21. Все модели имеют один и тот же механизм, с помощью которого они подвергаются гипероксии во время раннего развития сетчатки, а затем возвращаются в нормоксическую среду. Смит и др. отметили, что подвергание детенышей мышей гипероксии от Р7 в течение 5 дней индуцировало крайнюю форму регрессии сосудов в центральной сетчатке и возвращение их в комнатный воздух при Р12 постепенно вызывало неоваскулярные пучки, которые росли к стекловидному телу19. Это была стандартизированная модель мыши OIR, также называемая моделью Смита. Connor et al. дополнительно оптимизировали протокол и предоставили универсально применимый метод количественной оценки области VO (vaso-obliteration) и NV (неоваскуляризация) в 2009 году, что увеличило принятие и использование модели22. Модель мыши OIR по-прежнему является наиболее широко используемой моделью в настоящее время из-за ее небольшого размера, быстрого размножения, четкого генетического фона, хорошей повторяемости и высокого уровня успеха.
У мышей васкуляризация сетчатки начинается после рождения с врастанием сосудов от головки зрительного нерва во внутреннюю сетчатку к ora serrata. Во время нормального развития сетчатки первые сосуды сетчатки прорастают из головки зрительного нерва вокруг рождения, образуя расширяющуюся сеть (первичное сплетение), которая достигает периферии вокруг постнатального дня 7 (P7) 23. Затем сосуды начинают расти в сетчатку, образуя глубокий слой, проникая в сетчатку и создавая ламинарную сеть вокруг внутреннего ядерного слоя (INL), как у человека24. К концу третьей постнатальной недели (Р21) развитие более глубокого сплетения почти завершено. Для мышиной модели OIR сосудистая окклюзия всегда появляется в центральной сетчатке из-за быстрой дегенерации большого количества незрелых сосудистых сетей в центральной области во время воздействия гипероксии. Так, рост патологической неоваскуляризации происходит и в средне периферической сетчатке, которая является границей неперфузионной области и сосудистой области. Однако сосуды сетчатки человека почти сформировались еще до рождения. Что касается недоношенных детей, то периферическая сетчатка не полностью васкуляризуется при воздействии гипероксии25,26. Так окклюзия сосудов и неоваскуляризация в основном появляются в периферической сетчатке27,28. Несмотря на эти различия, мышиная модель OIR точно повторяет патологические события, которые происходят во время неоваскуляризации, вызванной ишемией.
Индукцию модели OIR можно разделить на две фазы29: в фазе 1 (фаза гипероксии) развитие сосудов сетчатки останавливается или замедляется при окклюзии и регрессии кровеносных сосудов в результате снижения VEGF и апоптоза эндотелиальных клеток 24,30; в фазе 2 (фаза гипоксии) снабжение сетчатки кислородом станет недостаточным в условиях воздуха в помещении29, что необходимо для развития нервной системы и гомеостаза 19,31. Эта ишемическая ситуация обычно приводит к нерегулируемой, аномальной неоваскуляризации.
В настоящее время широко используемым методом моделирования является чередование высокого / низкого воздействия кислорода: матери и их детеныши подвергаются воздействию 75% кислорода в течение 5 дней при P7, а затем 5 дней в комнатном воздухе, пока P17 не продемонстрирует сопоставимые результаты22, что является конечной точкой индукции мышиной модели OIR. (Рисунок 1). В дополнение к моделированию РН, эта опосредованная ишемией патологическая неоваскуляризация также может быть использована для изучения других ишемических заболеваний сетчатки. Основные измерения этой модели включают количественную оценку площади VO и NV, которые анализируются из плоских креплений сетчатки путем иммунофлуоресцентного окрашивания или перфузии FITC-декстрана. Каждую мышь можно изучить только один раз из-за смертельной операции. В настоящее время существует мало методов наблюдения динамических изменений сосудистой системы сетчатки непрерывно в процессе сосудистой регрессии и патологического ангиогенеза32. В этой статье мы предоставляем подробный протокол индукции модели OIR, анализ плоских креплений сетчатки, а также рабочий процесс флуоресцеиновой ангиографии глазного дна (FFA) на мышах, что было бы полезно для получения более полного понимания сосудистых динамических изменений в течение двух фаз мышиной модели OIR.
На восприимчивость мышей к ОИР влияют многие факторы. Детенышей разного генетического происхождения и штаммов сравнивать нельзя. У мышей-альбиносов BALB/c сосуды быстро возвращаются в область VO со значительным снижением неоваскулярных пучков38, что создает некоторые трудно?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех членов нашей лаборатории и лаборатории офтальмологических животных Чжуншаньского офтальмологического центра за их техническую помощь. Мы также благодарим профессора Чуньцяо Лю за экспериментальную поддержку. Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC: 81670872; Пекин, Китай), Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (грант No 2019A1515011347) и проект строительства больницы высокого уровня из Государственной ключевой лаборатории офтальмологии в Офтальмологическом центре Чжуншань (грант No 303020103; Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |