Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.
Zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) wordt veel gebruikt om abnormale vaatgroei bij ischemische retinale ziekten te bestuderen, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) en retinale ader occlusie (RVO). De meeste OIR-studies observeren retinale neovascularisatie op specifieke tijdstippen; de dynamische vaatgroei in levende muizen langs een tijdsverloop, die essentieel is voor het begrijpen van de OIR-gerelateerde vaatziekten, is echter onderbelicht. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de inductie van het OIR-muismodel, waarbij we de potentiële valkuilen benadrukken en een verbeterde methode bieden om snel gebieden van vaso-obliteratie (VO) en neovascularisatie (NV) te kwantificeren met behulp van immunofluorescentiekleuring. Wat nog belangrijker is, we hebben de hergroei van bloedvaten in levende muizen van P15 tot P25 gevolgd door fluoresceïne fundusangiografie (FFA) uit te voeren in het OIR-muismodel. De toepassing van FFA op het OIR-muismodel stelt ons in staat om het verbouwingsproces tijdens de hergroei van het vat te observeren.
Retinale neovascularisatie (RNV), die wordt gedefinieerd als een toestand waarin nieuwe pathologische vaten afkomstig zijn van bestaande retinale aderen, strekt zich meestal uit langs het binnenoppervlak van het netvlies en groeit onder sommige omstandigheden uit tot de glasvochtige (of subretinale ruimte)1. Het is een kenmerk en gemeenschappelijk kenmerk van veel ischemische retinopathieën, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie (RVO) en proliferatieve diabetische retinopathie (PDR)2.
Talrijke klinische en experimentele waarnemingen hebben aangetoond dat ischemie de belangrijkste oorzaak is van retinale neovascularisatie 3,4. Bij ROP worden pasgeborenen blootgesteld aan zuurstof op hoog niveau in gesloten couveuses om de overlevingskansen te verhogen, wat ook een belangrijke drijfveer is voor het stoppen van vasculaire groei. Nadat de behandeling is voltooid, ervaren de netvliezen van pasgeborenen een relatief hypoxische periode5. Andere situaties worden gezien in de occlusie van centrale of branch retinale aderen in RVO en schade aan retinale haarvaten wordt ook waargenomen die wordt veroorzaakt door microangiopathie in PDR2. Hypoxie verhoogt verder de expressie van angiogene factoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) via de hypoxie-geïnduceerde factor-1α (HIF-1α) signaalroute die op zijn beurt vasculaire endotheelcellen begeleiden om in het hypoxische gebied te groeien en nieuwe bloedvaten te vormen 6,7.
ROP is een soort vasculaire proliferatieve retinopathie bij te vroeg geboren baby’s en een belangrijke oorzaak van kinderblindheid 8,9, die wordt gekenmerkt door retinale hypoxie, retinale neovascularisatie en fibreuze hyperplasie 10,11,12. In de jaren 1950 ontdekten onderzoekers dat een hoge concentratie zuurstof de ademhalingssymptomen van premature baby’s aanzienlijk kan verbeteren13,14. Als gevolg hiervan werd zuurstoftherapie in toenemende mate gebruikt bij premature baby’s op dat moment15. Gelijktijdig met het wijdverbreide gebruik van zuurstoftherapie bij te vroeg geboren baby’s, nam de incidentie van ROP echter jaar na jaar toe. Sindsdien hebben onderzoekers zuurstof gekoppeld aan ROP en verschillende diermodellen onderzocht om de pathogenese van ROP en RNV16 te begrijpen.
Bij de mens wordt de meeste retinale vasculatuurontwikkeling voltooid vóór de geboorte, terwijl bij knaagdieren de retinale vasculatuur zich na de geboorte ontwikkelt, wat een toegankelijk modelsysteem biedt om angiogenese in de retinale vasculatuur te bestuderen2. Met de voortdurende voortgang van het onderzoek zijn zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) modellen belangrijke modellen geworden voor het nabootsen van pathologische angiogenese als gevolg van ischemie. Er zijn geen specifieke diersoorten in de studie van het OIR-model en het model is ontwikkeld bij verschillende diersoorten, waaronder kitten17, rat18, muis19, beagle puppy20 en zebravis21. Alle modellen delen hetzelfde mechanisme waarmee ze worden blootgesteld aan hyperoxie tijdens de vroege retinale ontwikkeling en vervolgens terugkeren naar de normoxische omgeving. Smith et al. merkten op dat het blootstellen van muispups aan hyperoxie van P7 gedurende 5 dagen een extreme vorm van vaatregressie in het centrale netvlies veroorzaakte en ze terugbracht naar de kamerlucht op P12, geleidelijk neovasculaire plukjes veroorzaakte, die naar het glasachtig lichaam groeiden19. Dit was een gestandaardiseerd OIR-muismodel dat ook wel Smith-model wordt genoemd. Connor et al. hebben het protocol verder geoptimaliseerd en een universeel toepasbare methode geleverd om het gebied van VO (vaso-obliteratie) en NV (neovascularisatie) in 2009 te kwantificeren, waardoor de acceptatie en het gebruik van het model22 is toegenomen. Het OIR-muismodel is nu nog steeds het meest gebruikte model vanwege zijn kleine formaat, snelle reproductie, duidelijke genetische achtergrond, goede herhaalbaarheid en hoge slagingspercentage.
Bij muizen begint retinale vascularisatie na de geboorte met de ingroei van bloedvaten van de oogzenuwkop in het binnenste netvlies naar de ora serrata. Tijdens de normale retinale ontwikkeling ontspruiten de eerste retinale vaten rond de geboorte uit de oogzenuwkop en vormen ze een uitdijend netwerk (de primaire plexus) dat de periferie bereikt rond postnatale dag 7 (P7) 23. Dan beginnen de vaten in het netvlies te groeien om een diepe laag te vormen, het netvlies binnen te dringen en een laminair netwerk rond de binnenste nucleaire laag (INL) te vormen zoals bij de mens24. Tegen het einde van de derde postnatale week (P21) is de diepere plexusontwikkeling bijna voltooid. Voor het OIR-muismodel verschijnt vasculaire occlusie altijd in het centrale netvlies vanwege de snelle degeneratie van een groot aantal onrijpe vasculaire netwerken in het centrale gebied tijdens blootstelling aan hyperoxia. De groei van pathologische neovascularisatie vindt dus ook plaats in het midden-perifere netvlies, wat de grens is van het niet-perfusiegebied en het vasculaire gebied. Menselijke retinale vaten hebben zich echter bijna voor de geboorte gevormd. Wat premature baby’s betreft, is het perifere netvlies niet volledig gevasculariseerd bij blootstelling aan hyperoxie25,26. Vasculaire occlusie en neovascularisatie komen dus vooral voor in het perifere netvlies27,28. Ondanks deze verschillen recapituleert het muis OIR-model nauw de pathologische gebeurtenissen die optreden tijdens door ischemie geïnduceerde neovascularisatie.
De inductie van het OIR-model kan worden onderverdeeld in twee fasen29: in fase 1 (hyperoxiefase) wordt de retinale vasculaire ontwikkeling gestopt of vertraagd met occlusie en regressie van bloedvaten als gevolg van de afname van VEGF en de apoptose van endotheelcellen24,30; in fase 2 (hypoxiefase) zal de retinale zuurstoftoevoer onvoldoende worden onder kamerluchtomstandigheden29, wat essentieel is voor neurale ontwikkeling en homeostase 19,31. Deze ischemische situatie resulteert meestal in ongereguleerde, abnormale neovascularisatie.
Momenteel is de veelgebruikte modelleringsmethode afwisselend hoge / lage zuurstofblootstelling: moeders en hun pups worden gedurende 5 dagen blootgesteld aan 75% zuurstof op P7 gevolgd door 5 dagen in kamerlucht totdat P17 vergelijkbare resultaten liet zien22, wat het eindpunt is van OIR-muismodelinductie. (Figuur 1). Naast het simuleren van ROP, kan deze ischemie-gemedieerde pathologische neovascularisatie ook worden gebruikt om andere ischemische retinale ziekten te bestuderen. De belangrijkste metingen van dit model omvatten het kwantificeren van het gebied van VO en NV, die worden geanalyseerd van retinale platte mounts door immunofluorescentiekleuring of FITC-dextran-perfusie. Elke muis kan slechts één keer worden bestudeerd vanwege de dodelijke operatie. Op dit moment zijn er weinig methoden om dynamische veranderingen van retinale vasculatuur continu te observeren tijdens het proces van vasculaire regressie en pathologische angiogenese32. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van OIR-modelinductie, analyse van retinale flat mounts en een workflow van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) op muizen, wat nuttig zou zijn om een uitgebreider begrip te krijgen van vasculaire dynamische veranderingen tijdens twee fasen van het OIR-muismodel.
De gevoeligheid van muizen voor OIR wordt beïnvloed door vele factoren. De pups met verschillende genetische achtergronden en stammen kunnen niet worden vergeleken. Bij BALB/c albino muizen groeien bloedvaten snel terug in het VO-gebied met significante verminderde neovasculaire plukjes38, wat het onderzoek enigszins bemoeilijkt. Bij C57BL/6-muizen is er sprake van verhoogde fotoreceptorschade in vergelijking met BALB/cJ-muizenstam39,40. …
The authors have nothing to disclose.
We bedanken alle leden van ons laboratorium en het oogheelkundig dierenlaboratorium van Zhongshan Ophthalmic Center voor hun technische assistentie. We bedanken ook Prof. Chunqiao Liu voor experimentele ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, China), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (Grant No.2019A1515011347), en high-level ziekenhuisbouwproject van state key laboratory of ophthalmology in Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincie Guangdong, China).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |