Overvåking av dynamisk vekst av retinale kar i oksygenindusert retinopati musemodell

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert metode for fremstilling og immunfluorescensfarging av mus retinal flat mounts og analyse. Bruk av fluorescein fundus angiografi (FFA) for musunger og bildebehandling er også beskrevet i detalj.

Abstract

Oksygenindusert retinopati (OIR) er mye brukt til å studere unormal karvekst i iskemiske retinale sykdommer, inkludert retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal vene okklusjon (RVO). De fleste OIR-studier observerer retinal neovaskularisering på bestemte tidspunkter; Imidlertid har den dynamiske fartøyveksten i levende mus langs et tidskurs, som er avgjørende for å forstå OIR-relaterte fartøyssykdommer, blitt understudert. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for induksjon av OIR-musemodellen, fremhever potensielle fallgruver og gir en forbedret metode for raskt å kvantifisere områder med vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) ved hjelp av immunfluorescensfarging. Enda viktigere, vi overvåket gjenvekst av fartøy i levende mus fra P15 til P25 ved å utføre fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. Anvendelsen av FFA til OIR-musemodellen lar oss observere ombyggingsprosessen under gjenvekst av fartøy.

Introduction

Retinal neovaskularisering (RNV), som er definert som en tilstand der nye patologiske kar stammer fra eksisterende retinale vener, strekker seg vanligvis langs den indre overflaten av netthinnen og vokser inn i glasslegemet (eller subretinalt rom under noen forhold)¹. Det er et kjennetegn og vanlig trekk ved mange iskemiske retinopatier, inkludert retinopati av prematuritet (ROP), retinal vene okklusjon (RVO) og proliferativ diabetisk retinopati (PDR)².

Tallrike kliniske og eksperimentelle observasjoner har indikert at iskemi er hovedårsaken til retinal neovaskularisering ^3,4. I ROP blir nyfødte utsatt for oksygen på høyt nivå i lukkede inkubatorer for å øke overlevelsesraten, noe som også er en viktig driver for arrestasjon av vaskulær vekst. Etter at behandlingen er ferdig, opplever netthinnen til nyfødte en relativt hypoksisk periode⁵. Andre situasjoner ses ved okklusjon av sentrale eller grenede retinale vener i RVO, og skade på retinale kapillærer observeres også som skyldes mikroangiopati i PDR². Hypoksi øker ytterligere uttrykket av angiogene faktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) gjennom den hypoksi-induserte faktor-1α (HIF-1α) signalveien som igjen styrer vaskulære endotelceller til å vokse inn i det hypoksiske området og danne nye kar ^6,7.

ROP er en slags vaskulær proliferativ retinopati hos premature spedbarn og en ledende årsak til barndomsblindhet ^8,9, som er preget av retinal hypoksi, retinal neovaskularisering og fibrøs hyperplasi^10,11,12. På 1950-tallet fant forskerne at høy konsentrasjon av oksygen kan forbedre respiratoriske symptomer hos premature spedbarn^{betydelig 13,14}. Som et resultat ble oksygenbehandling i økende grad brukt hos premature spedbarn på den tiden¹⁵. Samtidig med den utbredte bruken av oksygenbehandling hos premature barn, økte imidlertid forekomsten av ROP år for år. Siden da har forskere koblet oksygen til ROP, og utforsket ulike dyremodeller for å forstå patogenesen til ROP og RNV¹⁶.

Hos mennesker er de fleste retinal vaskulaturutvikling fullført før fødselen, mens hos gnagere utvikler retinal vaskulatur etter fødselen, og gir et tilgjengelig modellsystem for å studere angiogenese i retinal vaskulatur². Med den kontinuerlige utviklingen av forskningen har oksygenindusert retinopati (OIR) -modeller blitt viktige modeller for å etterligne patologisk angiogenese som følge av iskemi. Det er ingen spesifikke dyrearter i studien av OIR-modellen, og modellen er utviklet i ulike dyrearter, inkludert kattunge 17, rotte¹⁸, mus¹⁹, beagle valp 20 og sebrafisk²¹. Alle modellene deler den samme mekanismen som de blir utsatt for hyperoksi under tidlig retinal utvikling og deretter returnert til det normoksiske miljøet. Smith og medarbeidere observerte at eksponering av musevalper for hyperoksi fra P7 i 5 dager induserte en ekstrem form for karregresjon i den sentrale netthinnen og bringe dem tilbake til romluften ved P12 gradvis utløste neovaskulære tufter, som vokste mot glasslegemet¹⁹. Dette var en standardisert OIR-musemodell også kalt Smith-modell. Connor og medarbeidere optimaliserte protokollen ytterligere og ga en universelt anvendelig metode for å kvantifisere området VO (vaso-utslettelse) og NV (neovaskularisering) i 2009, noe som økte aksepten og utnyttelsen av modellen²². OIR-musemodellen er fortsatt den mest brukte modellen nå på grunn av sin lille størrelse, raske reproduksjon, klare genetiske bakgrunn, god repeterbarhet og høy suksessrate.

Hos mus starter retinal vaskularisering etter fødselen med innvekst av kar fra optisk nervehode inn i den indre netthinnen mot ora serrata. Under normal retinal utvikling spirer de første retinale karene fra optisk nervehode rundt fødselen, og danner et ekspanderende nettverk (den primære plexus) som når periferien rundt postnatal dag 7 (P7) ²³. Deretter begynner karene å vokse inn i netthinnen for å danne et dypt lag, trenge inn i netthinnen og etablere et laminært nettverk rundt det indre kjernefysiske laget (INL) som i menneske²⁴. Ved slutten av den tredje barseluken (P21) er dypere plexusutvikling nesten fullført. For OIR-musemodellen vises vaskulær okklusjon alltid i den sentrale netthinnen på grunn av den raske degenerasjonen av et stort antall umodne vaskulære nettverk i det sentrale området under hyperoxia-eksponering. Så forekommer veksten av patologisk neovaskularisering også i den midterste perifere netthinnen, som er grensen til ikke-perfusjonsområdet og det vaskulære området. Imidlertid har menneskelige retinale kar nesten dannet seg før fødselen. Når det gjelder premature spedbarn, blir den perifere netthinnen ikke fullstendig vaskularisert når den blir utsatt for hyperoksi^25,26. Så vaskulær okklusjon og neovaskularisering forekommer hovedsakelig i perifer retina^27,28. Til tross for disse forskjellene rekapitulerer muse-OIR-modellen nøye de patologiske hendelsene som oppstår under iskemi-indusert neovaskularisering.

Induksjonen av OIR-modellen kan deles inn i to faser²⁹: i fase 1 (hyperoxia-fase) blir retinal vaskulær utvikling arrestert eller forsinket med okklusjon og regresjon av blodkar som følge av nedgangen i VEGF og apoptose av endotelceller ^24,30; I fase 2 (hypoksifase) vil oksygentilførselen i netthinnen bli utilstrekkelig under romluftforhold²⁹, noe som er avgjørende for nevral utvikling og homeostase ^19,31. Denne iskemiske situasjonen resulterer vanligvis i uregulert, unormal neovaskularisering.

For tiden er den ofte brukte modelleringsmetoden vekslende høy / lav oksygeneksponering: Mødre og deres valper blir utsatt for 75% oksygen i 5 dager ved P7 etterfulgt av 5 dager i romluft til P17 viste sammenlignbare resultater²², som er endepunktet for OIR-musemodellinduksjon. (Figur 1). I tillegg til å simulere ROP, kan denne iskemimedierte patologiske neovaskulariseringen også brukes til å studere andre iskemiske retinale sykdommer. Hovedmålingene av denne modellen inkluderer kvantifisering av området VO og NV, som analyseres fra retinale flate fester ved immunfluorescensfarging eller FITC-dekstran perfusjon. Hver mus kan bare studeres en gang på grunn av den dødelige operasjonen. For tiden er det få metoder for å observere dynamiske endringer av retinal vaskulatur kontinuerlig under prosessen med vaskulær regresjon og patologisk angiogenese³². I dette papiret gir vi en detaljert protokoll for OIR-modellinduksjon, analyse av retinale flatfester, samt en arbeidsflyt av fluorescein fundus angiografi (FFA) på mus som vil være nyttig for å få en mer omfattende forståelse av vaskulære dynamiske endringer i to faser av OIR-musemodellen.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer bruk av mus ble godkjent av dyreforsøkets etiske komité ved Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Kina (autorisert nummer: 2020-082), og i samsvar med de godkjente retningslinjene for dyrepleie og brukskomité for Zhongshan Ophthalmic Center og Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. 1. Induksjon av mus OIR-modell Bruk mus med lavere frekvens av medfødt misdann…

Representative Results

I OIR-musemodellen er det viktigste og grunnleggende resultatet kvantifiseringen av VO- og NV-området. Etter å ha levd i hyperoksimiljøet i 5 dager fra P7, viste den sentrale netthinnen til valpene det største ikke-perfusjonsområdet. Under stimulering av hypoksi i ytterligere 5 dager ble retinal neovaskularisering gradvis produsert som fluorescerte mer intenst enn omkringliggende normale kar. Etter P17 gikk fluorescenssignalet til patologisk neovaskularisering raskt tilbake som ombygging av netthinnen (<strong class…

Discussion

Musens følsomhet for OIR påvirkes av mange faktorer. Valpene med ulik genetisk bakgrunn og stammer kan ikke sammenlignes. I BALB / c albino mus, fartøy regrow inn i VO området raskt med betydelig redusert neovaskulær tufts³⁸, noe som bringer noen vanskeligheter for forskningen. I C57BL/6 mus er det økt fotoreseptorskade sammenlignet med BALB/cJ musestamme^39,40. Det samme gjelder for forskjellige typer transgene mus^4…

Materials

1 mL sterile syringe	Solarbio	YA0550	For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube	Corning	MCT-200-C	For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides	Various		For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		For image analysis
Carbon dioxide gas	Various		For sacrifice
Cover slide	Various		For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps	World Precision Instruments	14127	For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution	Abcam	ab228549	For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope	Olmpus	SZ61	For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium	Sigma-Aldrich	F6377	For in vivo imaging
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2	For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose	Maya	89161	For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody	Invitrogen	I21413	For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J	GemPharmatech of Jiangsu Province		For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242	For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6	For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum	Abcam	ab7475	For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor	Various		For monitoring the level of O2
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148-1KG	For tissue fixation
Pentobarbital sodium	Various		For anesthesia
Soda lime	Various		For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0	IBM		For statistical analysis
Tansference decloring shaker	Kylin-Bell	ZD-2008	For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)	Corning	3261-20EA	For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes	Various		For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide	Various		For in vivo imaging
ZEN Imaging Software	ZEISS		For image acquisition and export