En rottelungetransplantationsmodel af varm iskæmi / reperfusionsskade: optimeringer for at forbedre resultaterne
Summary
Her præsenterer vi optimeringer til en rottelungetransplantationsmodel, der tjener til at forbedre resultaterne. Vi leverer en størrelsesguide til manchetter baseret på kropsvægt, en målestrategi til bestemmelse af det 4. interkostale rum og metoder til sårlukning og BAL (bronchoalveolær skylning) væske og vævsopsamling.
Abstract
Fra vores erfaring med rottelungetransplantation har vi fundet flere områder, der kan forbedres. Oplysninger i den eksisterende litteratur om metoder til valg af passende manchetstørrelser til lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronchus (Br) varieres, hvilket gør bestemmelsen af korrekt manchetstørrelse under rottelungetransplantation til en øvelse af forsøg og fejl. Ved at standardisere manchetteknikken til at bruge den mindste effektive manchet, der passer til størrelsen på karret eller bronchus, kan man gøre transplantationsproceduren sikrere, hurtigere og mere vellykket. Da diametre på PV, PA og Br er relateret til rottens kropsvægt, præsenterer vi en strategi for at vælge en passende størrelse ved hjælp af en vægtbaseret vejledning. Da lungevolumen også er relateret til kropsvægt, anbefaler vi, at dette forhold også bør overvejes, når man vælger den korrekte luftmængde til donorlungeinflation under varm iskæmi samt til den korrekte mængde PBS, der skal indføres under bronchoalveolær skylning (BAL) væskeopsamling. Vi beskriver også metoder til 4. interkostal rumdissektion, sårlukning og prøveindsamling fra både de indfødte og transplanterede lapper.
Introduction
I over tre årtier har forskere ændret og forbedret rottelungetransplantationsmodeller, så de genererede data er mere konsistente og mere reflekterende for den faktiske kliniske tilstand. I vores laboratoriums tid med at udføre denne model har vi bestemt fire forbedringsområder: manchetteknikker til anastomoser, identifikation af modtagerens 4. interkostale rum, lungeinflation og sårlukning under modtagerens procedure og høst af prøver til analyse.
Modifikationer af manchetteknik til anastomoser kan forbedre hele transplantationsproceduren ved at forkorte håndteringstiden for donorlungen 1,2,3,4,5,6 og gøre anastomoseproceduren hurtigere og teknisk lettere for mikrokirurgen. Selvom det er afgørende at bruge manchetter i den rigtige størrelse til at levere det nødvendige blod og luftstrøm til den transplanterede lunge, er der begrænset vejledning om, hvordan man skal vælge størrelsen på manchetter til lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronchus (Br) 5,7,8,9. Da diametrene på PV, PA og Br er relateret til donor- og modtagerrotternes kropsvægt, foreslår vi, at manchetstørrelsen baseres på kropsvægt. Denne rapport giver en størrelsesguide til manchetter baseret på en rottes kropsvægt (180 g til over 270 g), der tjener til at optimere blod- og lufttilførslen til den transplanterede lunge (tabel 1).
Mens en nyere mikrokirurg med succes og nemt kan skaffe en donorlunge under donorproceduren, er transplantation af lungen under modtagerens procedure mere kompliceret og afhænger af mikrokirurgens erfaring. Forsøg på at finde det 4. interkostale rum for at få adgang til modtagerens venstre lunge er et af de vanskeligere trin, der indeholder en vis subjektivitet og kan øge proceduretiden. Derfor introducerer vi en enkel og objektiv metode til at hjælpe med at identificere den 4. interkostale rumplacering ved hjælp af brystmålinger og hjertebanken for at finde den korrekte brystvæg til at dissekere 4,5,6,10,11,12.
Vi foreslår også en forbedring af donorlungeinflationen, som er en potentiel kilde til skade på organet. Donorlungen tømmes, indtil reperfusionen starter. Under suturering af det 4. interkostale rum oppustes donorlungen almindeligvis ved at øge PEEP fra 2 cmH 2 O til 6 cmH2O. For at minimere lungeskader fra overinflation foreslår vi en teknik, hvor tre 6-0 nylonsuturer placeres omkring den 4. ribben ringere end den 5. ribben med enkle dobbelte knuder. Når det er tid til sårlukning, holdes enderne af de tre suturer med hæmostater i begge hænder, såret lukkes på én gang ved at trække op på hver side, og PEEP reduceres straks til 2 cmH2O. På denne måde får lungen lov til at udvide sig i kortest mulig tid10.
Ved afslutningen af et eksperiment ønsker forskeren ofte at indsamle mange typer prøver til mange typer analyser fra hver transplantation. For eksempel kan snapfrosset væv, formalin fast væv, væv til våd-til-tørvægtsforhold for at bestemme lungeødem og bronchoalvelolær skylning (BAL) væske alle bruges til at vurdere, hvor godt transplantationen gik. Den traditionelle metode til opsamling af BAL-væske giver mulighed for en blandet poolet prøve fra både modtagerens oprindelige lobes og donorens transplanterede lap13,14,15. For at overvinde dette præsenterer vi en metode til at fastspænde hilarområderne, der kan give mere præcis indsigt i de transplanterede og indfødte lungers tilstand. Derudover er mængden af PBS, der bruges til at opsamle BAL-væske fra hver side af lungerne, vigtig at overveje, fordi BAL-væske indeholder adskillige opløselige faktorer såsom cytokiner og kemokiner, der måles ved koncentration. Normalisering af volumenet af væsken indlagt til det estimerede volumen af lungekapacitet kan hjælpe med sammenligning. Med fire lapper på højre side og en lap på venstre side har hver af rottens fem lapper et andet volumen og overfladeareal16. Ifølge en tidligere undersøgelse af volumenmåling af lungelapper af Backer et al. er volumenet af højre lobes af det samlede volumen af hele lungen 63% (4400 mm 3) og venstre lap 37% (2500 mm3). Derfor anbefaler vi, at mængden af PBS, der anvendes til opsamling af BAL-væske, beregnes som to gange tidevandsvolumen (7,2 ml/kg) ganget med 63 % for højre lunge og 37 % for venstre lunge. Ved at bruge denne tilgang kan man bedre kontrollere for variabler som kropsvægt og timing10,16.
Alt i alt vil vi i denne rapport demonstrere nogle få ændringer til den standard eksperimentelle model for rottelungetransplantation, der kan gøre proceduren mere effektiv og øge evnen til at generere mere nøjagtige og rigelige data fra hvert forsøg.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapport har vi grebet ind på flere kritiske trin i en rottelungetransplantationsprotokol for at optimere proceduren. Mens forskellige manchetteknikker til rottelungetransplantation er blevet rapporteret 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
