Een rattenlongtransplantatiemodel van warme ischemie / reperfusieletsel: optimalisaties om de resultaten te verbeteren
Summary
Hier presenteren we optimalisaties voor een longtransplantatiemodel bij ratten die dienen om de resultaten te verbeteren. We bieden een maattabel voor manchetten op basis van lichaamsgewicht, een meetstrategie om de 4eintercostale ruimte te bepalen en methoden voor wondsluiting en BAL (bronchoalveolaire lavage) vloeistof- en weefselverzameling.
Abstract
Vanuit onze ervaring met longtransplantatie bij ratten hebben we verschillende verbeterpunten gevonden. Informatie in de bestaande literatuur over methoden voor het kiezen van geschikte manchetmaten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) is gevarieerd, waardoor het bepalen van de juiste manchetgrootte tijdens longtransplantatie bij ratten een oefening van vallen en opstaan is. Door de manchettechniek te standaardiseren om de kleinste effectieve manchet te gebruiken die geschikt is voor de grootte van het vat of de bronchus, kan men de transplantatieprocedure veiliger, sneller en succesvoller maken. Omdat diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de rat, presenteren we een strategie voor het kiezen van een geschikte maat met behulp van een op gewicht gebaseerde gids. Aangezien het longvolume ook gerelateerd is aan het lichaamsgewicht, raden we aan dat deze relatie ook moet worden overwogen bij het kiezen van het juiste luchtvolume voor donorlonginflatie tijdens warme ischemie en voor het juiste volume PBS dat moet worden ingebracht tijdens bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistofverzameling. We beschrijven ook methoden voor4e intercostale ruimtedissectie, wondsluiting en monsterverzameling van zowel de inheemse als de getransplanteerde lobben.
Introduction
Al meer dan drie decennia zijn onderzoekers bezig met het aanpassen en verbeteren van longtransplantatiemodellen bij ratten, zodat de gegenereerde gegevens consistenter zijn en meer een afspiegeling zijn van de werkelijke klinische toestand. In de tijd dat ons laboratorium dit model uitvoerde, hebben we vier verbeterpunten bepaald: manchettechnieken voor anastomosen, identificatie van de 4eintercostale ruimte van de ontvanger, longinflatie en wondsluiting tijdens de procedure van de ontvanger en het oogsten van monsters voor analyse.
Manchettechniekaanpassingen voor anastomosen kunnen de hele transplantatieprocedure verbeteren door de behandelingstijd van de donorlong 1,2,3,4,5,6 te verkorten en de anastomoseprocedure sneller en technisch gemakkelijker te maken voor de microchirurg. Hoewel het van cruciaal belang is om de juiste maat manchetten te gebruiken om het nodige bloed en de luchtstroom naar de getransplanteerde long te leveren, is er beperkte begeleiding met betrekking tot hoe men de grootte van manchetten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) 5,7,8,9 moet kiezen. Aangezien de diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de donor- en ontvangerratten, stellen we voor dat de manchetgrootte wordt gebaseerd op het lichaamsgewicht. Dit rapport biedt een maattabel voor manchetten op basis van het lichaamsgewicht van een rat (180 g tot meer dan 270 g) die dient om de bloed- en luchttoevoer naar de getransplanteerde long te optimaliseren (tabel 1).
Terwijl een nieuwere microchirurg met succes en gemakkelijk een donorlong kan verkrijgen tijdens de donorprocedure, is het transplanteren van de long tijdens de procedure van de ontvanger ingewikkelder en afhankelijk van de ervaring van de microchirurg. Pogingen om de 4eintercostale ruimte te vinden om toegang te krijgen tot de linkerlong van de ontvanger is een van de moeilijkere stappen die enige subjectiviteit bevat en de proceduretijd kan verlengen. Daarom introduceren we een eenvoudige en objectieve methode om te helpen bij de identificatie van de4e intercostale ruimtelocatie door gebruik te maken van borstmetingen en de hartkloppingen om het juiste gebied borstwand te vinden om 4,5,6,10,11,12 te ontleden.
We stellen ook een verbetering voor van de donorlonginflatie, die een potentiële bron van letsel aan het orgaan is. De donorlong loopt leeg totdat de reperfusie begint. Tijdens het hechten van de 4eintercostale ruimte wordt de donorlong gewoonlijk opgeblazen door de PEEP te verhogen van 2 cmH 2 O naar 6 cmH2O. Om longletsel door overinflatie te minimaliseren, stellen we een techniek voor waarbij drie 6-0 nylon hechtingen worden geplaatst rond de 4e rib inferieur aan de5e rib met eenvoudige dubbele knopen. Wanneer het tijd is voor wondsluiting, worden de uiteinden van de drie hechtingen vastgehouden met hemostaten in beide handen, wordt de wond in één keer gesloten door aan elke kant omhoog te trekken en wordt PEEP onmiddellijk teruggebracht tot 2 cmH2O. Op deze manier kan de long zo kort mogelijk uitzetten10.
Aan het einde van een experiment wil de onderzoeker vaak vele soorten monsters verzamelen voor vele soorten analyses van elke transplantatie. Snap bevroren weefsel, formaline vast weefsel, weefsel voor nat-droog gewichtsverhouding om longoedeem te bepalen en bronchoalvelolar lavage (BAL) vloeistof kunnen bijvoorbeeld allemaal worden gebruikt om te beoordelen hoe goed de transplantatie is verlopen. De traditionele methode voor het verzamelen van BAL-vloeistof maakt een gemengd gepoold monster mogelijk van zowel de inheemse lobben van de ontvanger als de getransplanteerde kwab van de donor13,14,15. Om dit te ondervangen, presenteren we een methode om de hilaire gebieden te klemmen die nauwkeuriger inzicht kan geven in de toestand van de getransplanteerde en inheemse longen. Bovendien is het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof van elke kant van de longen te verzamelen belangrijk om te overwegen, omdat BAL-vloeistof tal van oplosbare factoren bevat, zoals cytokines en chemokines die worden gemeten op basis van concentratie. Het normaliseren van het volume van de vloeistof die wordt ingebracht tot het geschatte volume van de longcapaciteit kan helpen bij het vergelijken. Met vier lobben aan de rechterkant en één lob aan de linkerkant, heeft elk van de vijf lobben van de rat een ander volume en oppervlak16. Volgens een eerdere studie over volumemeting van longkwabben door Backer et al., van het totale volume van de hele long is het volume van de rechterkwabben 63% (4400 mm 3) en de linkerkwab 37% (2500 mm3). Daarom raden we aan dat het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof te verzamelen, moet worden berekend als tweemaal het getijdenvolume (7,2 ml / kg) vermenigvuldigd met 63% voor de rechterlong en 37% voor de linkerlong. Door deze aanpak te gebruiken, kan men beter controleren op variabelen zoals lichaamsgewicht en timing10,16.
Al met al zullen we in dit rapport enkele wijzigingen in het standaard experimentele model van longtransplantatie bij ratten demonstreren die de procedure efficiënter kunnen maken en het vermogen kunnen vergroten om nauwkeurigere en overvloedigere gegevens van elk experiment te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport hebben we ingegrepen bij verschillende kritieke stappen in een longtransplantatieprotocol bij ratten om de procedure te optimaliseren. Hoewel verschillende manchettechnieken voor longtransplantatie bij ratten zijn gemeld 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
