Un modelo de trasplante de pulmón de rata de lesión por isquemia/reperfusión caliente: optimizaciones para mejorar los resultados
Summary
Aquí, presentamos optimizaciones para un modelo de trasplante de pulmón de rata que sirven para mejorar los resultados. Proporcionamos una guía de tamaño para los puños basada en el peso corporal, una estrategia de medición para determinar el4º espacio intercostal y métodos de cierre de heridas y recolección de líquido y tejido BAL (lavado broncoalveolar).
Abstract
A partir de nuestra experiencia con el trasplante de pulmón de rata, hemos encontrado varias áreas de mejora. La información en la literatura existente con respecto a los métodos para elegir los tamaños apropiados del manguito para la vena pulmonar (PV), la arteria pulmonar (AP) o el bronquio (Br) es variada, lo que hace que la determinación del tamaño adecuado del manguito durante el trasplante de pulmón de rata sea un ejercicio de prueba y error. Al estandarizar la técnica de manguito para usar el manguito efectivo más pequeño apropiado para el tamaño del vaso o bronquio, se puede hacer que el procedimiento de trasplante sea más seguro, más rápido y más exitoso. Dado que los diámetros de PV, PA y Br están relacionados con el peso corporal de la rata, presentamos una estrategia para elegir un tamaño apropiado utilizando una guía basada en el peso. Dado que el volumen pulmonar también está relacionado con el peso corporal, recomendamos que esta relación también se considere al elegir el volumen adecuado de aire para la inflación pulmonar del donante durante la isquemia caliente, así como para el volumen adecuado de PBS que se instilará durante la recolección de líquido del lavado broncoalveolar (BAL). También describimos métodos para la4ª disección del espacio intercostal, el cierre de la herida y la recolección de muestras de los lóbulos nativos y trasplantados.
Introduction
Durante más de tres décadas, los investigadores han estado modificando y mejorando los modelos de trasplante de pulmón de ratas para que los datos generados sean más consistentes y reflejen mejor la condición clínica real. En el tiempo que nuestro laboratorio realiza este modelo, hemos determinado cuatro áreas de mejora: técnicas de manguito para anastomosis, identificación del4º espacio intercostal del receptor, inflado pulmonar y cierre de la herida durante el procedimiento del receptor, y la recolección de muestras para su análisis.
Las modificaciones de la técnica de manguito para anastomosis pueden mejorar todo el procedimiento de trasplante al acortar el tiempo de manipulación del pulmón del donante 1,2,3,4,5,6 y hacer que el procedimiento de anastomosis sea más rápido y técnicamente más fácil para el microcirujano. Si bien es fundamental usar los manguitos del tamaño adecuado para suministrar la sangre y el flujo de aire necesarios al pulmón trasplantado, existe una orientación limitada con respecto a cómo se debe elegir el tamaño de los manguitos para la vena pulmonar (PV), la arteria pulmonar (PA) o el bronquio (Br)5,7,8,9. Dado que los diámetros de PV, PA y Br están relacionados con el peso corporal de las ratas donantes y receptoras, proponemos que el tamaño del manguito se base en el peso corporal. Este informe proporciona una guía de tamaño para los manguitos basada en el peso corporal de una rata (180 g a más de 270 g) que sirve para optimizar el suministro de sangre y aire al pulmón trasplantado (Tabla 1).
Si bien un microcirujano más nuevo puede obtener con éxito y facilidad un pulmón de un donante durante el procedimiento del donante, trasplantar el pulmón durante el procedimiento del receptor es más complicado y depende de la experiencia del microcirujano. Los intentos de encontrar el4º espacio intercostal para acceder al pulmón izquierdo del receptor es uno de los pasos más difíciles que contiene cierta subjetividad y puede aumentar el tiempo del procedimiento. Por lo tanto, introducimos un método simple y objetivo para ayudar en la identificación de la4ª ubicación del espacio intercostal mediante el uso de mediciones de tórax y las palpitaciones del corazón para encontrar el área correcta de la pared torácica para diseccionar 4,5,6,10,11,12.
También proponemos una mejora en la inflación pulmonar del donante, que es una fuente potencial de lesión en el órgano. El pulmón del donante se desinfla hasta que comienza la reperfusión. Al suturar el4º espacio intercostal, el pulmón del donante se infla comúnmente aumentando la PEEP de 2 cmH 2O a 6 cmH2O. Con el fin de minimizar la lesión pulmonar por sobreinflado, proponemos una técnica en la que se colocan tres suturas de nylon 6-0 alrededor de la4ª costilla inferior a la5ª costilla con nudos dobles simples. Cuando llega el momento del cierre de la herida, los extremos de las tres suturas se sostienen con hemostáticos en ambas manos, la herida se cierra de una vez tirando hacia arriba a cada lado y la PEEP se reduce inmediatamente a 2 cmH2O. De esta manera, se permite que el pulmón se expanda durante el menor tiempo posible10.
Al final de un experimento, el investigador a menudo quiere recolectar muchos tipos de muestras para muchos tipos de análisis de cada trasplante. Por ejemplo, el tejido congelado a presión, el tejido fijo de formalina, el tejido para la relación de peso húmedo a seco para determinar el edema pulmonar y el líquido de lavado broncoalvelolar (BAL) se pueden usar para evaluar qué tan bien fue el trasplante. El método tradicional de recolección de líquido BAL permite una muestra combinada mixta tanto de los lóbulos nativos del receptor como del lóbulo trasplantado del donante13,14,15. Para superar esto, presentamos un método de pinzamiento de las áreas hiliares que puede proporcionar una visión más precisa de la condición de los pulmones trasplantados y nativos. Además, es importante considerar el volumen de PBS utilizado para recolectar líquido BAL de cada lado de los pulmones porque el líquido BAL contiene numerosos factores solubles como citoquinas y quimiocinas que se miden por concentración. Normalizar el volumen del líquido instilado al volumen estimado de capacidad pulmonar puede ayudar con la comparación. Con cuatro lóbulos en el lado derecho y un lóbulo en el lado izquierdo, cada uno de los cinco lóbulos de la rata tiene un volumen y área de superficie diferente16. Según un estudio previo sobre la medición del volumen de los lóbulos pulmonares realizado por Backer et al., del volumen total de todo el pulmón el volumen de los lóbulos derechos es del 63% (4400 mm 3) y el lóbulo izquierdo es del 37% (2500 mm3). Por lo tanto, recomendamos que el volumen de PBS utilizado para recolectar líquido BAL se calcule como el doble del volumen corriente (7,2 ml / kg) multiplicado por 63% para el pulmón derecho y 37% para el pulmón izquierdo. Al usar este enfoque, se puede controlar mejor variables como el peso corporal y el tiempo10,16.
En total, en este informe demostraremos algunas modificaciones al modelo experimental estándar de trasplante de pulmón de rata que pueden hacer que el procedimiento sea más eficiente y aumentar la capacidad de generar datos más precisos y abundantes de cada experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, hemos intervenido en varios pasos críticos en un protocolo de trasplante de pulmón de rata para optimizar el procedimiento. Si bien se han reportado varias técnicas de manguito para el trasplante de pulmón de rata 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
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