ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法
Summary
ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腎臓オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、2週間以内に腎臓オルガノイドを生成する。得られた腎臓オルガノイドは、大規模なスピナーフラスコまたはマルチウェル磁気攪拌プレートで培養して、薬物試験アプローチを並行させることができます。
Abstract
hPSCから生成された腎臓オルガノイドは、腎組織の無限の供給源を提供してきた。ヒト腎臓オルガノイドは、腎臓病や傷害の研究、細胞ベースの治療法の開発、新しい治療法の試験のための非常に貴重なツールです。このような用途には、多数の均一なオルガノイドと再現性の高いアッセイが必要です。私たちは、オルガノイドの全体的な健康状態を改善するために、以前に発表された腎臓オルガノイドプロトコルに基づいて構築しました。この単純で堅牢な3Dプロトコルは、脂質、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミンサプリメント、ポリビニルアルコールを含む最小成分培地でGSK3阻害剤(CHIR99021)で3日間均一な胚様体を形成し、その後ノックアウト血清置換(KOSR)含有培地で培養することを含む。さらに、攪拌アッセイは、胚様体の凝集を減少させ、均一なサイズを維持することを可能にし、これはオルガノイド間の変動性を低減するために重要である。全体として、このプロトコルは、大量の腎臓オルガノイドを生成するための迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法を提供する。
Introduction
近年、ヒト多能性幹細胞を腎臓オルガノイドに分化させるための多くのプロトコールが開発されている1、2、3、4、5。腎臓オルガノイドは、新しい再生医療アプローチの研究、腎臓関連疾患のモデル化、毒性試験の実施、治療薬開発を支援するための重要なツールを提供してきました。その幅広い適用性にもかかわらず、腎臓オルガノイドは、成熟の欠如、インビトロでの限られた長期培養能力、およびヒト腎臓に見られるいくつかの細胞型の不足などの限界を有する6,7,8。最近の研究は、オルガノイド成熟のレベルを改善し、培養期間を延長し、既存のプロトコル9、10、11、12を修正することによって腎臓細胞集団の複雑さを拡大することに焦点を当てている。我々の確立されたプロトコル5,13のこの現在の反復において、我々は、プロトコルの第1段階における培地成分を、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン(ITSE)、脂質、ポリビニルアルコール(E5-ILP)およびCHIR99021を添加した無血清ベース培地に改変した(図1)。これらの変更により、完全に定義された無血清の低タンパク質培地が提供され、以前の培地組成物5,13よりも成分が少なく、追加の成長因子が存在しません。その結果、第1段階培地は、以前に公開されたバージョンよりも調製に労力がかからず、バッチ間の変動性を低減する可能性があります5。これまでの研究では、インスリンとトランスフェリンの両方が無血清培養において重要であることが示されている14,15が、高レベルのインスリンは中胚葉分化を阻害し得る16。我々は、元のプロトコールで提供されたように低いインスリンレベルを維持し、アッセイの第2段階でKOSR(インスリンを含む)のレベルをさらに低下させた。腎臓オルガノイド形成のための他のプロトコールに沿って、より低いレベルのKOSRは、腎臓組織の増殖と分化との間のバランスを維持するのに有益である17。また、ステージII培地13におけるグルコース濃度を低下させた。
我々の方法は、腎臓オルガノイドの懸濁アッセイのためのセットアップを記載し、元の刊行物5、13に記載されているように、初期〜60%コンフルエントhPSC 100mm培養プレートから最大〜1,000個のオルガノイドを生じる。このプロトコルは、複数の100 mmまたは150 mmプレートから始めて簡単にスケールアップして、オルガノイド数をさらに増やすことができます。
Protocol
hPSCを用いたすべての実験は、施設のガイドラインに準拠して実施され、適切な個人用保護具を備えたクラスIIバイオセーフティフード内で実施された。すべての試薬は、特に断りのない限り、細胞培養グレードである。全ての培養物を37°C、5%CO2 空気雰囲気下でインキュベートする。アッセイのすべての段階で、胚様体または腎臓オルガノイドを収集、固定、または分析のために調製…
Representative Results
私たちのプロトコルのこの最新バージョンでは、腎臓オルガノイドの分化は、定義された低タンパク質培地で開始されます。アッセイは完全に懸濁状態で行われ、尿細管形成の開始のためのhPSCs分化および組織化の先天的能力に依存する。100mm〜60%コンフルエントなhPSC培養プレートに由来する単一のアッセイは、我々の以前の刊行物5に示されているように、日常的に500〜1,00…
Discussion
以前の研究では、初期プロトコールステップが中間中胚葉分化5、19、20にとって重要であることが示されており、したがって、この段階で厳格な培地組成物を実施することが不可欠である。プロトコールの第1段階から血清、アルブミン、タンパク質非含有ハイブリドーマ培地IIなどの未定義成分を除去することは、アッセ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所R01 DK069403、UC2 DK126122およびP30-DK079307、およびASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship ProgramからAPへの資金提供を受けました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Przepiorski, A., Crunk, A. E., Holm, T. M., Sander, V., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62452, doi:10.3791/62452 (2021).