İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem
Summary
Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC’ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.
Abstract
hPSC’lerden üretilen böbrek organoidleri, sınırsız bir böbrek dokusu kaynağı sağlamıştır. İnsan böbrek organoidleri, böbrek hastalığı ve hasarını incelemek, hücre bazlı tedaviler geliştirmek ve yeni terapötikleri test etmek için paha biçilmez bir araçtır. Bu tür uygulamalar için, çok sayıda üniform organoid ve yüksek oranda tekrarlanabilir tahlillere ihtiyaç vardır. Organoidlerin genel sağlığını iyileştirmek için daha önce yayınlanmış böbrek organoid protokolümüzün üzerine inşa ettik. Bu basit, sağlam 3D protokolü, 3 gün boyunca lipitler, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin takviyesi ve GSK3 inhibitörü (CHIR99021) ile polivinil alkol içeren minimum bileşen ortamında üniform embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından nakavt serum replasmanı (KOSR) içeren ortamda kültürü içerir. Ek olarak, ajitasyon tahlilleri, embriyoid cisimlerin kümelenmesinde azalmaya ve organoidler arasındaki değişkenliği azaltmak için önemli olan düzgün bir boyutun korunmasına izin verir. Genel olarak, protokol büyük miktarlarda böbrek organoidi üretmek için hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.
Introduction
Son yıllarda, insan pluripotent kök hücrelerini böbrek organoidlerine ayırmak için bir dizi protokol geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Böbrek organoidleri, yeni rejeneratif tıp yaklaşımlarına yönelik araştırmalara yardımcı olmak, böbrekle ilgili hastalıkları modellemek, toksisite çalışmaları yapmak ve terapötik ilaç geliştirmek için önemli bir araç sağlamıştır. Geniş uygulanabilirliklerine rağmen, böbrek organoidlerinin olgunlaşma eksikliği, in vitro sınırlı uzun süreli kültür kapasitesi ve insan böbreğinde bulunan çeşitli hücre tiplerinin azlığı gibi sınırlamaları vardır 6,7,8. Son çalışmalar, organoid olgunlaşma seviyesini iyileştirmeye, kültür sürelerini uzatmaya ve mevcut protokollerideğiştirerek böbrek hücresi popülasyonlarının karmaşıklığını genişletmeye odaklanmıştır 9,10,11,12. Yerleşik protokolümüzün 5,13’ünün bu mevcut yinelemesinde, protokolün ilk aşamasındaki ortam bileşenlerini, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin (ITSE), lipitler, polivinil alkol (E5-ILP) ve CHIR99021 ile desteklenmiş serumsuz bir baz ortama değiştirdik (Şekil 1). Bu değişiklikler, önceki orta bileşimimiz 5,13’ten daha az bileşene sahip ve ek büyüme faktörleri olmadan, tam olarak tanımlanmış, serum içermeyen, düşük proteinli bir ortam sağlar. Sonuç olarak, ilk aşama ortamının hazırlanması daha önce yayınlanmış sürümümüze göre daha az emek yoğundur ve partiden partiye değişkenliğiazaltabilir 5. Önceki çalışmalar, serumsuz kültür14,15’te hem insülin hem de transferrinin önemli olduğunu göstermiştir, ancak yüksek insülin seviyeleri mezoderm farklılaşmasına inhibide olabilir16. Orijinal protokolde belirtildiği gibi düşük insülin seviyelerini koruduk ve tahlilin ikinci aşamasında KOSR seviyelerini (insülin içeren) daha da azalttık. Böbrek organoid oluşumu için diğer protokollere uygun olarak, daha düşük KOSR seviyeleri, böbrek dokusunun çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi korumak için faydalıdır17. Ek olarak, Aşama II ortam13’ümüzdeki glikoz konsantrasyonunu düşürdük.
Yöntemimiz, orijinal yayın 5,13’te açıklandığı gibi, başlangıçtaki ~% 60 birleşik hPSC 100 mm kültür plakasından ~ 1.000 organoid veren böbrek organoidlerinin süspansiyon testi için bir kurulum tanımlamaktadır. Bu protokol, organoid sayılarını daha da artırmak için birden fazla 100 mm veya 150 mm plaka ile başlayarak kolayca ölçeklendirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalar, ilk protokol adımlarının ara mezoderm farklılaşması 5,19,20 için kritik olduğunu ve bu nedenle bu aşamada sıkı bir orta bileşimin uygulanmasının gerekli olduğunu göstermiştir. Serum, albümin, proteinsiz hibridoma medium II gibi tanımlanmamış bileşenlerin protokolün ilk aşamasından çıkarılması, tahliller21 arasındaki tutarlı farklılaşma verimliliğini…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DK069403, UC2 DK126122 ve P30-DK079307 ve ASN Böbrek Araştırmaları Vakfı Ben J. Lipps Araştırma Burs Programı tarafından AP’ye finanse edilmiştir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
Riferimenti
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
